[发明专利]纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法。 

背景技术

随着纳米技术在生命科学领域中不断应用，越来越多的具有独特性质的纳米材料逐渐被人们发现。纳米金(AuNPs)是纳米技术中应用较为广泛的一种的微小金颗粒，其直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。由于这种特殊的物理、化学性质和生物相容性, 胶状的金纳米粒子在生物电化学、材料学及生物医学等领域有很广泛的应用。 

近年来，有学者发现纳米金能提高PCR体系的扩增效率。台湾成功大学LiM等报导了纳米金能提高PCR体系的扩增效率，随后一系列关于纳米金优化PCR的研究应用和机理探索很快展开；李海阔等（2009）利用纳米金粒子扩增人类基因组的低拷贝基因模板，实现了对复杂体系中低拷贝基因的扩增，提高了特异性扩增的产率；沈鹤柏等（2005）将引物连接在纳米金粒子表面，研究基于纳米金粒子的PCR，将均相体系中的PCR 技术扩展到纳米粒子表面。同时，Li 等（2005）利用10 nm的纳米金粒子显著提高了PCR 的特异性和改善非特异扩增。 

纳米金应用于荧光定量PCR反应中也有了初步的研究。Huang 等（2008）在日本脑炎病毒RNA 的实时定量反转录PCR 反应体系中加入13 nm 的纳米金粒子后，不但可以提高了反转录PCR 产量，减少了扩增时间，而且提高了低拷贝病毒RNA 基因的检测灵敏度。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高扩增效率，增加检测灵敏度，为病毒性疾病的准确快速检测提供技术支持的纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法。 

为实现上述目的，本发明纳米金荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的非诊断性方法，在反应体系中加入适量的纳米金，来对实时荧光定量PCR反应体系进行催化和优化。 

进一步，所述纳米金为10nm纳米金。 

进一步，所述方法的具体步骤包括：1）提取病毒的核酸；2）确定反应体系中纳米金溶液浓度，建立纳米金荧光定量PCR反应体系；3）通过检测未知样品，检测黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒来验证该反应体系的有效性。 

进一步，所述实时荧光定量PCR反应体系扩增具体为配制设定组分浓度的25μL PCR反应体系。 

进一步，在所述实时荧光定量PCR反应体系中，其探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。 

进一步，所述实时荧光定量PCR反应体系适用于ABI实时PCR系统、BioRad 实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。 

本发明利用纳米金对实时荧光定量PCR的催化作用，在其反应体系中加入适量的10nm纳米金，针对已有的引物和探针，优化PCR反应体系，对病毒样本进行实时定量检测。该法相较于一般的荧光定量PCR方法在灵敏度检测上有一定的提高、提高扩增效率，增加检测灵敏度，为病毒性疾病的准确快速检测提供技术支持。 

附图说明

图1 为荧光定量PCR反应中加入不同浓度的纳米金后，病毒RNA扩增荧光强度随反应循环数变化的曲线图； 

图2 为纳米金荧光定量PCR(A表示)与未加纳米金荧光定量PCR（B表示）灵敏度的检测结果的曲线图；

图3 为用本发明建立的方法对未知样本的RNA进行检测的曲线图；

图4 为用本发明建立的方法对黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒的样本RNA进行交叉反应检测的曲线图。

具体实施方式

下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。 

本发明中的基本方法：荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒核酸的方法，其中公开了相应的基本方法步骤和引物、探针，本发明中仍然可以采用上述的引物、探针。所述探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA等 

本发明检测方法其次包括检测基孔肯雅病毒核酸的步骤，该步骤具体为：

（1）核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906 病毒RNA提取试剂盒；

（2）确定反应体系中纳米金溶液浓度