[发明专利]大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于大鲵病害检测技术领域，更具体涉及一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对大鲵虹彩病毒进行定量检测。同时还涉及一种大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒的用途。

技术背景

大鲵(Andrias davidiamus)俗称娃娃鱼，是国家二级保护动物，并且被列入CITES公约(濒危野生动植物种国际贸易公约)种类目录中，是现存个体最大的两栖类动物，有很重要的科研价值及药用和营养价值。但是，由于人为捕猎和自然环境的改变，野生大鲵数量急剧下降(Wang X M，Zhang K J，Wang Z H，et al.The decline of the Chinese giant salamander Andrias davidianus and implications for its conservation[J].Cambridge Journal，2004，38：197-202.)基于保护和开发利用的目的，目前兴起了大鲵的人工养殖。人工养殖很难完全模仿自然状态下大鲵的生活环境，加之对大鲵的一些生活习性尚不清楚，所以在饲养过程中出现了诸多问题，其中疾病是影响大鲵养殖业发展的重要因素之一。已往在大规模养殖过程中出现的主要疾病都是由细菌引起(陈祥云，陈新民.大鲵病害研究综述[J].渔业现代化，2006(5)：25-267.)但2010年曾令兵利用EPC细胞在国内外首次成功地从患典型出血病的大鲵幼鱼、成鱼体内分离到病毒。从患病鱼体内分离的病毒感染细胞培养物，细胞可发生典型的细胞病变效应，病毒可通过连续传代进行培养。病毒核酸特异性PCR反应可扩增出与预期大小一致的DNA片段，对扩增产物进行测序与比对分析，其序列与蛙虹彩病毒序列的同源性达到了99％以上，被初步确认为大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus，GSIV)。

目前大鲵的人工养殖发展迅速，已形成经济价值巨大的产业。但是，大鲵虹彩病毒造成的影响随着大鲵养殖规模与范围的不断扩大而日趋严重，造成巨大经济损失，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行监控，保证大鲵养殖业的健康发展。近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用(Petersen E，Edvinsson B，Lundgren B，et al.Diagnosis of pulmonary infection with Toxoplasma gondii in immunocompromised HIV-positive patients by real-ime PCR[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2006，25(6)：401-404.；Goldschmidt P，Rosne H，Saint-jean C，et al.Effects of topical anaesthetims and fluorescein Oil the real-time PCR used for the diagnosis of Herpesviruses and Acanthamoeba keratitis[J].Br J ophthalmol，2006，90(11)：1354-1356.；Regis S，Grossi，Laldi S，et al.Diagnosis of Pelizaeus-Merzbacher disease：detection of proteolipid protein gene copy numher by real-time PCR[J].Neurogenetics，2005，6(2)：73-78.；Lobetti R G，Tasker S.Diagnosis of feline haemoplasma infection using a real-time PCR assay[J].J S Afr Vet Assoc，2004，75(2)：94-99.；Ordinaire I，Simon A，Frealle E，et al.Real-time quantitative PCR for toxoplasmosis diagnosis[J].Ann Biol Clin，2005，63(1)：67-73.；Ovarnstrom Y，James C，Xayavong M，et al.Comparison of real-time PCR protocols for differential laboratory diagnosis of amebiasis[J].J Clin Microbiol，2005，43(11)：5491-5497.；Knorr L，Fox J D，Tilley P A，et al.Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetella pertussis infection[J].BMC Infect Dis，2006(6)：62-64.；Vanden B R，Kuijper E J，Vancopdenraer C L，et al.Rapid diagnosis oftoxinogenic Clostridium difficile in faeeal samples with internally controlled real-time PCR[J].Ciin Microbiol Infect，2006，12(2)：184-186.；Machida U，Kami M，FukuI T，et al.Real-time automated PCR for early diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection after bone marrow transplantation[J].J Clin Microbiol，2000，38(7)：2536-2542.)笔者建立了检测大鲵虹彩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，旨在对大鲵虹彩病毒进行定性和定量检测。而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成。