[发明专利]一种鸡胚培养及活体电转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及发育生物学及转基因技术领域，具体涉及一种鸡胚胎培养及鸡胚胎活体原位电转基因技术领域。

 

背景技术

鸡胚是组织胚胎发育和分子生物学等研究领域中的一种重要实验动物模型，与其它实验动物相比鸡胚具有发育周期短、遗传生理背景清楚、简单易得、易于操作等诸多优点。另外，鸡胚可以在体视显微镜下被操作，随后的发育也可以在体外被监控和录像，这是其它物种的胚胎无法取代的优势。随着鸡的基因组序列的发表和在鸡卵中进行对基因功能获得和缺失研究技术的发展，鸡胚模型进一步被广泛地应用于发育生物学、遗传学、细胞生物学和生物医学等各个领域，尤其在研究胚胎早期发育中起重大作用的基因功能方面拥有巨大的潜力。

 鸡胚发育模型是长期应用于发育生物学和细胞生物学研究的经典模型，目前常用的鸡胚培养方法主要有带壳培养和去壳培养两种。带壳培养优点在于，操作简单，培养成活率较高，胚胎在蛋壳内环境中存活时间长，适合早期基因转染技术的开展，其缺点在于，由于受开口大小限制，给后期的基因转染带来不便，在胚胎发育5天以后，很难实现注射和电击等过程，因此，只能用于培养5天以内鸡胚进行转染操作，而在胚胎发育的后期，带壳培养的模型便不适合相关基因功能的研究，因为在培养5天以上时，去除蛋壳的过程血管便和蛋壳发生粘连，无法保证去除部分蛋壳而不破坏血管。去壳培养，优点在于解决了带壳培养的不足，可以实现5天之后的较大胚胎基因转染技术的开展，而且在培养的过程中，胚胎始终是浮在蛋清上方的，有利于注射和观察等过程，Yalcin HC等人也证明鸡胚的去壳培养有利于成像和显微手术的开展（Yalcin HC,Shekhar A,Rane AA,Butcher JT.J Vis Exp,23 (44):10.3791/2154, 2010），缺点在于，培养操作难度大，容易污染，培养成活率较低，需要保证去除蛋壳过程中卵黄膜的完整性和血管不受损，卵黄在鸡胚的发育过程具有非常重要的作用，卵黄膜的破裂或卵黄的流失都会影响到胚胎的发育。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种成活率高的鸡胚培养方法。

本发明的目的还在于在鸡胚培养的基础上提供一种转化效率高的活体电转基因方法。

通过对传统培养方法的优化，建立鸡胚胎带壳和去壳培养技术，提高鸡胚成活率，为活体原位电转基因方法提供基础。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种鸡胚培养及活体电转基因方法，包括以下步骤：带壳培养，培养2天—3天时分别做带壳原位电转基因；去壳培养，将受精鸡蛋培养到第3天时，去壳置培养器皿放入恒温恒湿培养箱中培养；原位电转基因步骤，带壳培养2-3天将0.5μg/μl的质粒0.5-1μl用显微注射毛细玻璃针在体视显微镜下注射到脊髓或去壳培养5-6天注射到视顶部位，将电极放在已注射质粒的脊髓或视顶部位两侧，阳性电极在拟转基因一侧，进行电转；然后进行组织取材、包埋和切片。

所述的带壳培养步骤为，取新鲜受精鸡蛋，用温水洗净、擦干，在蛋壳上注明时间，将受精鸡蛋水平放入孵化箱，按所需时间从孵化箱中取出鸡蛋，不转动方向水平放入铺有餐巾纸的培养皿中。

所述孵化箱内培养温度37.8℃，相对湿度60%，转蛋间隔2小时。

所述的去壳培养步骤为，受精鸡蛋培养到第3天时，将胚胎转移到瓷碗中，加盖培养皿后，将其放入恒温恒湿培养箱培养，培养温度37.5℃，相对湿度60%。

所述的瓷碗为70mm口径的圆形凹底瓷碗，所述的培养皿为90mm口径的培养皿。

所述的原位电转基因步骤为，带壳培养2-3天将0.5μg/μl的质粒0.5-1μl用显微注射毛细玻璃针在体视显微镜下注射到脊髓或去壳培养5-6天注射到视顶部位，将电极放在已注射质粒的脊髓或视顶部位两侧，阳性电极在拟转基因一侧，进行电转， 2-3天的鸡胚蛋壳上方开口处用医用胶布密封，5-6天鸡胚在培养皿容器中重新加盖培养。

所述的电转电压为18V，电流为60mA，间隔90ms，电脉冲6次。

所述的组织取材、包埋和切片：取材时先固定再蔗糖脱水后包埋，包埋时先用锡箔纸做好柱状的模型，加入OCT，然后将胚胎放入，转入液氮；切片时将包埋好的组织固定并连续切片。