[发明专利]一种快速检测发酵液琥珀酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及琥珀酸发酵技术领域的检测方法，具体地，涉及一种基于琥珀酸与硫酸铜显色反应快速检测发酵液中琥珀酸含量的方法。

背景技术

琥珀酸(Succinic acid)是重要的有机酸产品，目前主要应用于以下四个领域：一是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；二是作为离子鳌合剂，用于电镀行业防止金属的溶蚀和点蚀；三是应用于食品行业作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂；四是应用医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产。琥珀酸在这四大领域中的销售量每年超过4亿美元。近年，我国中科院理化技术研究所工程塑料国家工程研究中心利用琥珀酸为聚合单体，与丁二醇缩聚合成高性能聚酯材料聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)取得突破性进展，并经过了万吨级生产装置验证，PBS有望成为我国第一种全生物降解材料，这对作为聚合原料的琥珀酸的市场扩大产生巨大的推动。此外，以琥珀酸为原料，还可直接合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、γ-丁内酯等重要的大宗化学品。鉴于琥珀酸日益增大的市场需求和广泛的用途，美国能源部2004年发布的报告《Top Value Added Chemicals From Biomass》将琥珀酸列为12种最有潜力的生物基平台化合物之首。

目前工业上生产琥珀酸的方法主要是以石油基产品丁烷为原料的化学合成方法，但化学法存在生产工艺要求严格，产品得率和纯度都不高，易造成环境污染，且使用原料不可再生等不足，采用环境友好的微生物发酵法生产琥珀酸将逐渐成为化学法的替代方案。在琥珀酸发酵生产菌的分离或选育过程中，需要及时、高通量地分析不同菌株发酵液中的琥珀酸含量，以快速鉴别挑取高产菌株；在琥珀酸发酵过程中，必须经常性的对发酵液中琥珀酸含量进行分析，以合理的控制发酵进程。

目前，琥珀酸的分析检测方法包括液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、薄层色谱法等。其中液相色谱法(中华人民共和国国家标准GB/T 5009.157-2003；曹剑磊等.产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能.应用与环境生物学报，2010，16(6)：851-857.)具有检出限低、重现性好、精密度高等优点，是目前发酵液琥珀酸的准确定量分析的常用方法，但HPLC需使用价格昂贵的液相色谱仪，成本高、检测时间长，而且对系统的各项要求也很高；毛细管电泳法(韦寿莲等.毛细管电泳对叶下珠中有机酸的分离检测.分析测试学报，2009，28(6)：692-696.)，气相色谱法(赵大云等.雪里蕻腌菜卤汁中有机酸成分气相色谱分析.上海交通大学学报(农业科学版)，2003，21(3)：220-225，245.)都存在使用设备昂贵、操作复杂繁琐、检测分析耗时久的相似问题，而且气相色谱法还需对琥珀酸进行衍生化处理，因此，这两种方法较少应用于发酵液琥珀酸的检测分析；有报道使用薄层层析法(何凌云等.薄层扫描法测定不同产区半夏药材中琥珀酸的含量.中成药，2002，24(4)：290-292.；王光忠等.薄层扫描法测定地龙类药材中琥珀酸的含量.药物分析杂志，1997，17(4)：274-275.)分析中药成分中琥珀酸的含量，但检测分析过程需要较长时间的层析展开，由于使用酸碱指示剂类显色剂染色，定量分析容易受发酵液中其他有机酸的干扰。

发明内容

本发明的目的在于针对目前技术的不足，提供一种利用硫酸铜与琥珀酸显色反应快速检测发酵液中琥珀酸含量的方法。这一方法根据铜试剂与琥珀酸在固体支持物上反应显色，在一定浓度范围内，琥珀酸浓度与显色斑的吸光值成线性关系，通过外标两点法计算琥珀酸的含量。

为实现以上目的，本发明专利采用的技术方案是：

(1)琥珀酸发酵液的预处理

使用无机酸碱调节发酵液pH，使发酵液中琥珀酸充分溶解。离心除去发酵液中的固形物，用蒸馏水制备成适当稀释倍数的待测样。

(2)薄层扫描快速分析琥珀酸含量

①配制硫酸铜-甲醇溶液：称取适量硫酸铜加入甲醇中，摇匀，至硫酸铜完全溶解。试剂现配现用。

②检测波长的选择：取标准琥珀酸溶液，点样于硅胶板(或醋酸纤维薄膜等固体支持物上)，加热固定后使用硫酸铜-甲醇溶液进行显色反应。使用薄层扫描仪对样品斑点及空白进行光谱扫描，以样品斑点最强吸收峰波长为测定波长，以空白最小光吸收为参比波长。