[发明专利]表达凝血因子VIII的表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及B区缺失重组人凝血因子VIII(B Domain delete recombinant human coagulation factor VIII，BDD-rhFVIII)的植物表达载体及其在植物中表达生产BDD-rhFVIII的应用。具体地，涉及BDD-rhFVIII的植物表达载体及利用小球藻生产BDD-rhFVIII的方法。

背景技术

血友病

血友病(Hemophilia)是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。包括血友病A(甲)、血友病B(乙)，因子XI缺乏症(曾称血友病丙)和vWF因子(vonwillibrand factor)缺乏的血管性假血友病，他们构成血友病的四种类型。前两者为性染色体——X染色体连锁的隐性遗传病，仅男性发病；因子XI缺乏症为常染色体不完全隐性遗传。血友病在先天性出血性疾病中最为常见。血友病A是由于血液中缺乏功能性的凝血因子VIII，而造成的出血不止的出血性疾病。

血友病A在男性人群中的患病率约为1/5000，占血友病总数的80％以上；血友病B在男性人群中的患病率约为1/30000，占血友病总数的10％～20％。中国是世界上人口最多的国家之一，估计血友病患者65,000-130,000例，国内调查显示，绝大多数血友病患者未得到及时的诊断和治疗(Zhang et al.，2003)。

血友病是遗传性、伴随终身的出血性疾病。身体各个部位都有可能发生出血，以关节最为常见，肌肉出血次之，内脏出血少见但病情较重。重型血友病儿童多于2岁左右发生关节出血，此后反复的关节出血导致慢性血友病性关节炎，进而因为关节畸形而导致残疾，几乎是血友病患者的共同结局。因此在欧美国家实施了血友病综合关怀的治疗模式，尤其是对重型血友病儿童实行预防治疗，使重型血友病由威胁生命的、严重影响生存质量的疾病转变成终生携带但可以正常生活的疾病。加拿大2006年统计，2663个血友病患者(占全国血友病患者的98％)中，进行预防治疗的儿童占84％(Biss et al，2008)。但我国血友病工作起步晚，血友病儿童的状况不容乐观。目前，本病在发展中国家(如我国)的致残率和病死率远高于发达国家。

FVIII的结构特点

FVIII是血浆中大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FVIII是治疗血友病A的唯一有效的制剂。FVIII基因定位在X染色体的长臂顶端(Gitschier et al.，1984)，长超过180kb。包含有26个外显子，最初翻译产物为2351个氨基酸(Vehar et al.，1984)的单链蛋白质，该蛋白质包含19个氨基酸的信号肽和2332个氨基酸的成熟蛋白质。FVIII是多结构域的大分子糖蛋白，一个成熟的蛋白质由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成。轻链分子量约为80kDa，结构包括A3，C1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至约200kDa，结构包括域A1，A2和B，连接方式为A1-A2-B(Vehar et al.，1984；Lenting et al.，1998)。重链中，B结构域上的氨基酸残基Asp，Ser和Thr被广泛的糖基化。重链和轻链的连接是金属离子依赖性的，依赖于在A1和A3区的氨基酸残基与金属离子的结合，A1和A3区包含有相互作用位点。

天然凝血因子VIII(FVIII)蛋白质前体共含有26个可能的糖基化位点，其中在B结构域上有19个；而本发明中的rhFVIII结构中，B结构域已被除去，只编码两个分子量分别约为90kD和80kD的重链和轻链，含6-7个糖基化位点，仍具有天然人凝血因子VIII的功能。

当FVIII在血液中循环时，它通常与载体蛋白——血管性因子结合。当被凝血酶和/或活化的FXa因子水解时，FVIII被激活，这过程也包括诱导血管性因子与FVIII的解离。FVIII一旦被激活，活化的FVIIIa反过来可以与其它因子一起激活凝血因子FX，产生活化的FXa。

血友病A的治疗方法通常包括输入血浆或全血，注射从血浆中浓缩的FVIII，注射从转基因哺乳动物或通过转基因动物细胞培养系统中分离得到的重组人凝血因子。从血浆或哺乳动物细胞培养系统生产第八因子可能是困难和成本过高。此外，血浆源性因子VIII可能含有污染物，例如，A型肝炎，B和C病原体以及细小病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的病原体等有害杂质。

凝血因子VIII的生产