[发明专利]一种含组成型启动子pPGK和G418抗性基因的酿酒酵母表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学基因工程领域，主要涉及一种酿酒酵母用G418为筛选标记的表达载体的构建方法，具体地涉及酿酒酵母以G418为选择性标记同时质粒上含有pPGK1启动子的质粒的构建方法。

背景技术

大肠杆菌E.coli表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统，但外源蛋白在大肠杆菌E.coli中常以不溶性的包涵体形式表达，产物纯化困难。同时，大肠杆菌作为表达宿主，尤其是对于真核基因的表达，翻译后的加工修饰体系不完善，表达的产物活性低或者没有活性。为了克服大肠杆菌表达系统的不足，需要发展新的真核表达系统。酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。

酿酒酵母是一种极为重要的工业微生物，也是一种重要的基因真核表达系统，常被用于生产多种生物物质，如氨基酸、酶、谷胱甘肽、乙醇等等。由于酿酒酵母全基因组已经测序，它被美国食品与药品安全管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证为安全的微生物，可以用于食品、制药等行业。但是，在酵母的基因操作领域常用的酿酒酵母表达载体如pYX212、pUG36多为营养缺陷作为筛选标记。这就要求宿主菌必须是营养缺陷型，大大限制了酵母菌基因工程研究中的受体菌的使用单位。使用各种理化因素将一株完整营养型的酵母通过筛选营养缺陷是目前常用而又最常见的方法。但是，诱变筛选是一个繁琐而又费时费力的过程，诱变存在很大的不确定性，而且容易产生回复突变。同时，筛选得到的营养缺陷菌株应用于实际生产中，需要添加必须的营养成分，无疑增加了生产成本。虽然，亦可以通过基因敲除手段构建营养缺陷菌株，但是存在着操作成本高，需要一系列基因操作，费时费力。因此常用的营养缺陷为筛选标记的质粒对于酿酒酵母基因工程操作过程中酿酒酵母转化体系的建立带来很大不便。

G418是一种氨基糖苷类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，是稳定转染最常用的选择试剂。已有研究表明，来自大肠杆菌转座子Tn903的卡那霉素抗性基因与表达调控序列来自丝状真菌Ashbya gossypii(针孢酵母)的TEF基因相融合，所组成的KanMX元件可以在酵母细胞中表达氨基糖苷磷酸转移酶，将G418转变成无毒形式，从而赋予酵母细胞以G418抗性。由于G418可用于选择细菌、酵母，植物和哺乳动物细胞。可以以G418作为筛选标记，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。将G418基因从pFA6a-GFPS65T-kanMX6表达载体上克隆下来连接到常用的表达载体上，使该载体获得G418抗性，有利于酿酒酵母转化子的筛选。

发明内容

本发明是克服上述技术的不足，构建出一种用G418为筛选标记酿酒酵母表达载体，并提供了一条可行的酿酒酵母表达载体构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

本发明以pYES 2.0载体作为基本骨架，以质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6为模板，采用PCR的方法克隆获得KanMX的抗性基因；同样以酿酒酵母基因组DNA为模板，采用PCR的方法获得PGK启动子片段，构建出具有G418抗性的组成型酿酒酵母表达载体；并以构建的表达载体，采用醋酸锂方法转化工业酿酒酵母二倍体菌株，使得转化后的菌株可以耐受120ug/ml的G418，使转化子的筛选简便易行。

1、KanMX抗性标记基因的克隆

根据pYES 2.0酶切位点特性，选择KanMX基因的插入位点，设计克隆KanMX基因的引物，两端分别含有Nhe I/Nde I酶切位点，以质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pMD18-T载体上，转入大肠杆菌E.coli DH5α，测序。命名该克隆载体为pMD18-T-KanMX。

2、G418抗性载体的构建

分别用限制性内切酶Nhe I和Nde I酶切pYES 2.0和pMD18-T-KanMX，回收相应片段，用T4 DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH5α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。载体命名为pYES-Kan1。

3、PGK启动子的克隆