[发明专利]一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫疫苗表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌分泌表达的日本血吸虫疫苗表达载体及其应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类及家畜健康的人畜共患寄生虫病，全球约6亿人生活在血吸虫疫区，2亿人受感染，1.2亿人出现临床症状，年死亡人数多达数十万。自研究出特效药吡喹酮后，通过群体化疗，对血吸虫病的流行已有所缓解，但是血吸虫病的传播仍然在持续，患病人数依然在增加。而且吡喹酮等化学药物的耐药性也在很大程度上影响了血吸虫病的防治（McManus DP，Clin Microbiol Rev，2008，21(1):225-242）。因此，为了更好的防治血吸虫病的传播和流行，急切需要开发一种高效、安全、价廉的血吸虫疫苗。

血吸虫疫苗研究先后经历了死疫苗、灭活或致弱疫苗、重组疫苗和核酸疫苗等阶段。虽然灭活疫苗显示了较高的保护力，但是其风险高；死疫苗、重组疫苗和核酸疫苗却面临着保护力不高，造价昂贵，接种不便等等问题。口服抗原递呈系统因其具有接种简单，价格便宜的优点，被广泛地应用于多种感染性疾病疫苗开发。活性减毒的沙门氏菌是一种理想的口服疫苗载体，其可通过口服途径，将外源抗原分子输送到抗原递呈细胞（APC）中，并通过组织相容性复合体递呈给T细胞，激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答。

Khan CM首次尝试利用沙门氏菌减毒株SL3261表达曼氏血吸虫28kd GST抗原，口服免疫小鼠后，在血清中检测到了针对GST抗原的抗体（Khan CM，Proc Natl Acad Sci. 1994，91(23):11261-11265）；Pacheco LG等利用减毒沙门氏菌SL3261表达曼氏血吸虫14 kd 脂肪酸结果蛋白，口服小鼠后获得了34.9%的减虫率（Acta Trop. 2005，95(2):132-142）。但是沙门氏菌一旦进入抗原递呈细胞后，便被限制在一种膜包裹的囊泡（Salmonella containing vacuole, SCV）之中（Zhang XL等，Cell Mol Immunol. 2008，5(2):91-97）。这种膜包裹的囊泡结构在很大程度上限制了抗原的有效递呈。因此，为了打破这个限制，开发一种高效的以口服减毒沙门氏菌为载体的血吸虫疫苗，需要面临抗原分子的分泌问题。

    因此，要建立一个高效的减毒沙门氏菌分泌表达日本血吸虫口服疫苗系统，必须构建一个高效的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的分泌表达，这是本发明要解决的问题。

发明内容

本发明需要解决的问题是建立一个高效的减毒沙门氏菌分泌表达日本血吸虫口服疫苗系统，构建一种高效的沙门氏菌分泌表达载体，以实现抗原分子在沙门氏菌中的分泌表达。

本发明的主要目的是构建高效的沙门氏菌分泌表达载体，实现抗原分子在体内稳定持续的分泌表达，为建立表达稳定、保护性效率高的以减毒沙门氏菌为运输载体的日本血吸虫口服疫苗奠定基础。

为了达到上述目的，本发明利用Ⅲ型分泌系统和溶血素分泌系统对血吸虫抗原分子进行分泌，将Ⅲ型分泌信号和溶血素分泌信号与抗原分子融合来实现对包括日本血吸虫在内的抗原的分泌，所述的Ⅲ型分泌信号可以为沙门氏菌外膜蛋白E N端1-104氨基酸序列等原核细菌Ⅲ型分泌效应蛋白的分泌信号序列；所述的溶血素分泌信号为hlyA 蛋白N端34个氨基酸和C端61个氨基酸序列；所述的抗原分子为sj23LHD-GST双价抗原等疫苗抗原。

进一步地，本发明提供了一种血吸虫口服疫苗递呈系统，其特征是以减毒沙门氏菌为口服疫苗输送载体，以分泌表达的方式递呈日本血吸虫抗原分子，所述的减毒细菌株可以是减毒沙门氏菌VNP20009。

进一步地，本发明提供了一种稳定的以减毒沙门氏菌为载体的日本血吸虫分泌表达口服疫苗，质粒在体内表达稳定，不丢失。

与现有的血吸虫疫苗相比，本发明的特色和创新之处在于：

（1）发明了一种利用沙门氏菌分泌表达信号指导日本血吸虫疫苗抗原表达载体，实现了日本血吸虫双价抗原的分泌表达，并在小鼠模型证实利用该系统，可以实现肝脏减虫率达到41.69%，肝脏减卵率为57.71%。

（2）发明了一种口服形式的沙门氏菌介导的日本血吸虫疫苗，并在动物感染模型等证实口服该疫苗能够获得较高的针对抗原分子的体液免疫与细胞免疫反应。

（3）发明了一种成本低廉的日本血吸虫疫苗，本发明由于发明了一种高效表达、高效分泌的日本血吸虫疫苗抗原表达载体，再加上利用方便培养的沙门氏菌作为抗原表达工厂和递呈工具，具有大规模推广的应用前景。