[发明专利]实时荧光定量PCR检测人接触蛋白-1(CNTN-1)试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，通过将组织中的mRNA逆转录为cDNA，再通过实时荧光定量PCR精确的检测人接触蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)基因的mRNA水平。

背景技术

肿瘤严重威胁人类健康，早期诊断对提高患者的生存率和生活质量有非常重要的意义。肿瘤的早期发现，早期治疗，可降低筛查人群癌症死亡率，改善预后，提高生活质量，减少放化疗药物的使用率，降低治疗费用。然而肿瘤的早期诊断一直是一个没有攻克的难题，因而发现合适的肿瘤标志并合理的应用肿瘤标志进行早期诊断，具有重要现实意义。

肿瘤早期诊断是对患者的确认或对无症状患者的及时诊断。常用的筛查方法有子宫颈癌的巴氏涂片，结直肠癌的隐血试验，前列腺癌的肛指检查，食道癌的拉网等，但这些检查均不理想。计算机断层扫描、超声诊断、乳房摄影等检测的最小极限为1cm(10⁹细胞)直径的肿瘤。而聚合酶链反应可以检测细胞数在10⁷-10⁸的实体瘤，将肿瘤的早期诊断提高了一个数量级。

Real-time PCR，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过real-time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

肺癌和食管癌是全球和我国死亡率较高的恶性肿瘤，也是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率高，预后较差。人接触蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)是一种神经细胞黏附因子(NCAM)，参与了神经系统的发育。但是近年来发现人接触蛋白-1能介导肿瘤转移的分子，作为VEGF-C的下游效应分子，可介导肺癌和食管癌等的肿瘤转移和生长(Su JL，Yang PC，Shih JY，Yang CY，Wei LH，Hsieh CY，Chou CH，Jeng YM，Wang MY，Chang KJ，Hung MC，Kuo ML.The VEGF-C/Flt-4axis promotes invasion and metastasis of cancer cells.Cancer Cell，2006，9(3)：209-223；Liu P，Zhou J，Zhu H，Xie L，Wang F，Liu B，Shen W，Ye W，Xiang B，Zhu X，Shi R，Zhang S.VEGF-C promotes the development of esophageal cancer via regulating CNTN-1expression.Cytokine，2011，55(1)：8-17)。人接触蛋白-1在肺癌、食管癌细胞中呈高表达，并与肺癌、食管癌等患者预后有密切的关系。因而能灵敏、精确的检测CNTN-1基因mRNA的表达对于判断肿瘤患者的预后具有重要的意义。

发明内容

本发明的试剂盒包含逆转录反应缓冲液，不含RNA酶的水，Oligo(dT)₁₂，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，逆转录酶，MgCl₂溶液，聚合酶反应缓冲液，耐热的Taq DNA聚合酶，检测用上游、下游引物和阳性对照DNA。

其中逆转录反应体系包括逆转录反应溶液(250mM Tris-HCl(pH 8.3)，375mM KCl，50mM DTT)，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶，不含RNA酶的水，Oligo(dT)₁₂，dNTP混合物和RNA酶抑制剂。

聚合酶反应体系含有聚合酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl)，MgCl₂溶液(10mM)，耐热的Taq DNA聚合酶，dNTP混合物，检测用上游、下游引物，逆转录的cDNA或阳性对照DNA溶液。

检测用上游引物序列为：5’-GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’

下游引物序列为：5’-TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’

阳性对照DNA序列为：