[发明专利]基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用

权利要求书

1.辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的专用引物，由三组引物组成；第一组引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；第二组引物由序列表的序列5所示DNA、序列表的序列6所示DNA、序列表的序列7所示DNA、序列表的序列8所示DNA、序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；第三组引物由序列表的序列11所示DNA、序列表的序列12所示DNA、序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA组成。

2.权利要求1所述专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。

3.一种含有权利要求1所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有Bst DNA聚合酶。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有5倍LAMP反应液和/或样品预处理液；

所述5倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、pH8.8 100mM Tris-盐酸、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、10mM氯化镁、0.5mM氯化锰、25μM钙黄绿素、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱；

所述样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、pH8.2 10mM Tris、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20、0.01％明胶。

6.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫中的应用。

7.权利要求1所述专用引物在检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫中的应用。

8.一种辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用权利要求1所述专用引物中的三组引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；

(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；

(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测线虫为象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、A型甘薯腐烂茎线虫或B型甘薯腐烂茎线虫。

10.一种辅助鉴定待测植物样本中是否感染甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用权利要求1所述专用引物中的三组引物对待测植物样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；

(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；

(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫。