[发明专利]用于构建测序文库的系统与方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种接头元件及一种构建测序文库的方法。

背景技术

在现阶段，用于高通量基因测序的DNA片段都会首先制备成测序文库。测序文库的制备包括以下几个步骤，首先随机切割样品基因组，获得大量DNA片段，然后接上接头进行扩增反应。在构建文库过程当中，最大问题在于连接接头时很容易出现接头自连现象，同时由于接头连接的随意性，容易出现DNA片段两端连接上同一接头的非目标接头元件-DNA片段复合物，既浪费了原材料又增加了产物分离提纯的复杂程度。

对于一些简单的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)/DNA的插入/缺失(Indel)筛选，单端(single read)测序和双端(paired-end)测序均能满足要求，而结构变异筛选则需要pair-end或者mate-pair测序。目前应用最广的454DNA测序方法中一种构建测序文库的方法的基本步骤为：(1)片段化大核酸分子，以产生目标核酸；(2)将捕捉元件连接至目标核酸，以形成第一环形核酸分子；(3)用切割目标核酸但不切割捕捉元件的限制性内切核酸酶消化第一环形核酸，以产生含目标核酸的两个末端的线性核酸，所述两个末端由捕捉元件分隔；(4)将线性核酸与分隔元件连接，已形成第二环形核酸；(5)将第二环形核酸变为环形单链核酸；(6)使第一寡核苷酸与环形单链核酸退火，并通过滚环扩增来扩增环形单链核酸，以产生单链滚环扩增产物；(7)使第二寡核苷酸与单链滚环扩增产物退火，以在单链滚环扩增产物中形成多个双链区；(8)使用切割多个双链区的限制性内切酶将单链滚环扩增产物消化为小片段，以产生含目标核酸的两个末端区里的DNA构建物。该方法需要进行二次环化，同时由于环化的效率较低需要进行复杂的滚环扩增步骤，因此整个流程耗时长，操作复杂，成本高。

针对上述问题，需要一种能够在建库过程中避免自连的接头元件，同时需要建立一种在建库过程中能够避免出现接头自连及非目标接头元件-DNA片段复合物，而且耗时短、操作简便的建库新方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种接头元件，旨在解决现有技术在建库过程中出现接头自连的问题。

为了实现发明目的，所述接头元件是：

从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头，所述分叉区双链之间的碱基序列不能互补配对，所述分叉区的双链各包含至少一个引物结合位点；所述配对区包含至少一个酶切识别位点。

上述提供的分叉型双链核酸接头，其分叉设计能够在建库过程避免接头自连现象的出现；所述分叉区上包含的扩增引物结合位点，可以直接用于结合扩增引物，进行扩增反应；而酶切识别位点则可以在建库过程中酶切形成末端，便于进行后续的操作。

其中，所述接头元件的分叉区每条链含有N个核苷酸，其中9≤N≤30，两链之间的核苷酸不能配对。

其中，所述接头元件的配对区含有7～15对互补配对的核苷酸。

其中，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端或平末端。

进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端时，其突出末端与DNA片段的粘性末端互补配对。

更进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T。

更进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

本发明的目的之一在于提供一种构建测序文库的方法，旨在解决建库过程中出现接头自连及非目标接头元件-DNA片段复合物的问题。

为了实现发明目的，所述一种构建测序文库的方法包括：

A.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

B.目的DNA片段两端连接上述接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增得到扩增引物；

C.对扩增产物进行富集回收，形成测序文库。

所述方法利用分叉型双链核酸接头，能够在建库过程中避免出现接头之间自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物。

其中，在所述片段化处理步骤之后还包括目的DNA片段的分离纯化以及末端修饰的步骤。

其中，所述接头元件至少包括本发明所述接头元件中的一种。

其中，所述扩增引物是生物素化的扩增引物，该扩增引物可以是聚合酶链式反应引物，或是带有RNA转录酶初始序列的转录引物。