[发明专利]重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗化疗药所致白细胞减少症药物中的应用

说明书

本申请是“具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂”申请的分案申请。其原申请的申请日是2008年1月3日，申请号是200810050206.x，原发明的名称是“具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂”。

技术领域

本发明属于生物医药工程领域，涉及使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤用途及其抗肿瘤药物制剂。

背景技术

灵芝免疫调节蛋白(Immunoregulatory Protein of Ganoderma lucidium)，由日本Kino等人1989年从赤灵芝菌丝体提取物中分离和纯化的小分子蛋白质(Kohsuke Kino et al.，J.Boil.Chem.1989，1：472-478)，命名为LZ-8，并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KD，等电点为4.4。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的增生，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子(如白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等)，进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康，实现免疫调节功能。

很多研究表明，LZ-8发挥抗肿瘤作用主要是通过免疫调节途径实现。但本发明的积极效果在于首次公开了重组灵芝免疫调节蛋白(Recombinant Immunoregulatory Protein of Ganoderma Lucidium，rLZ-8)通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡来直接杀伤或杀死肿瘤细胞而发挥抗肿瘤的用途。在发挥作用的同时，不同于化疗药物会降低白细胞，rLZ-8会维持和升高白细胞，且不影响正常细胞的作用。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前尚无特别有效的防治策略。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学的不断发展，以及对肿瘤本质的阐明，大规模、快速筛选组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程。用不同方法启动或激活肿瘤细胞凋亡机制，影响细胞不同基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的影响和放化疗带来的副作用，已成为目前肿瘤治疗的重要策略。

本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，且无明显毒副作用，并能保持或升高白细胞的水平，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制抗肿瘤药物有一定的积极作用。

发明内容

1.公开了rLZ-8抗肿瘤作用及升高白细胞作用。

2.杀伤白血病细胞的药效学和细胞凋亡实验，药效学实验表明rLZ-8对白血病细胞NB4、K562和HL-60具有很强杀伤作用，流式细胞仪进行的细胞凋亡检测进一步证明了rLZ-8诱导人白血病细胞发生凋亡。

3.溶血实验、大鼠骨髓像实验和促红细胞凝聚实验证实其对正常细胞没有影响。

4.荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌细胞H22在体内生长。

5.蛋白荧光标记实验表明，rLZ-8可以通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。

6.rLZ-8药物制剂的核心成分含有重组灵芝免疫调节蛋白和任选的药学可接受的辅剂。

7.rLZ-8药物制剂可以通过口服和非肠道给药。

说明书附图说明：

图1rLZ-8对NB4肿瘤细胞体外杀伤结果

图2rLZ-8对K562肿瘤细胞体外杀伤结果

图3rLZ-8诱导K562和NB4细胞凋亡PI单染检测结果

图4rLZ-8诱导K562和HL-60细胞凋亡Annexin V/PI双染检测结果

图5用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化

图6接种S180艾氏腹水瘤细胞小鼠体重变化(横轴为时间(d)；纵轴为平均体重(g)；曲线符号-◆-代表S180组；-■-代表S180+rLZ-8组；-▲-代表CK组)

图7接种H22移植性肿瘤细胞小鼠体重变化((横轴为时间(d)；纵轴为平均体重(g)；曲线符号-◆-代表H22组；-■-代表H22+rLZ-8组；-▲-代表CK组))

图8FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对大鼠心肌组织的标记(暗、明场)

图9FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对兔软骨细胞的标记(暗、明场)

图10FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对HL-60细胞的标记(暗、明场)