[发明专利]一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置及应用

说明书

技术领域

本发明属生命科学、医学等多个领域检测装置，涉及一种用于数字核酸扩增的集成流路芯片装置及其应用。

背景技术

随着科学技术的飞速发展,尤其是生命科学的发展，生物医学的研究、应用，从整体和细胞水平，深入到分子水平，对许多疾病的诊断和治疗相关研究亦逐步进入基因水平。核酸作为生命体内最重要生物大分子之一是活细胞中最为关键的组分，它携带着遗传信息，是遗传的物质基础。虽然基因表达的最终产物是蛋白质，但是决定蛋白质和酶结构的却是核酸。因此对核酸进行系统有效的检测和分析将使人们对基因有更加深刻的了解和认识，并使其在遗传性疾病、肿瘤和传染病等医学领域以及法医学鉴定、食品安全、考古学等领域发挥重要作用。

近年来，核酸研究已经取得了令人瞩目的成绩，但同时也提出了更多新的挑战。随着医学水平的不断提高，临床上越来越多的提倡细针穿刺活检术等微创技术进行检测和治疗，这虽然减少了病人的痛苦和手术并发症，但与此同时，采集的样品量却大大减少，这就迫切要求发展适用于基因表达等相关研究和临床检测的微量或超微量样品检测技术。另外，核酸研究的难度还在于需要提高分析手段的灵敏度。从生物体细胞本身来讲，其中的遗传因子——核酸的含量是非常低的；从恶性肿瘤等与基因相关的重大疾病的诊断来看，病变组织细胞成分复杂、疾病早期阶段特征性mRNA表达水平变化小，疾病的诊断尤其是早期诊断需要实现高灵敏的核酸检测。目前往往采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)技术在体外扩增DNA，直到目的DNA浓度足以被检测为止。

聚合酶链式反应技术发明至今已经三十多年了，在这期间技术得到了不断的发展，1995年美国PE公司率先发明的荧光定量PCR技术，在普通的PCR反应系统中加入了一个与目的序列互补的双荧光标记探针——即分子信标，依靠分子信标荧光信号报告PCR产物，其强弱随PCR扩增进程不断加强，并与PCR产物的数量成正比，经特定的荧光光谱分析仪测得荧光强度，可实时动态定量观察PCR扩增的对数期、线性期和平台期的变化，与标准阳性定量梯度样品的标准曲线比较，进而推算出待检物的起始拷贝量。但是这种方法并不能对核酸进行计数，仍然不是绝对测量，无法做到单分子检测。

由Vogeinzler和Klstein发明的数字PCR技术大大扩展了常规PCR的应用。这项技术首先将待检测的DNA样品在多孔板里进行稀释，使得平均每两个孔里只有一个DNA分子，随后在优化好的PCR反应条件下进行PCR反应对单拷贝模板进行扩增。扩增产物与荧光探针结合，用不同的荧光对序列特异性的扩增产物进行检测。最后用贝叶斯定理型的统计学方法对PCR产物进行统计分析。数字PCR技术可以从最低限度稀释的样品中扩增单个的DNA分子，从而将从传统PCR反应获得的指数型模拟信号转变为线性的数字信号;能够做到真正意义上的绝对定量测定。2006年Ottesen等研制出可以对细菌多个基因进行精确定量的微流控数字PCR芯片，同年美国Fluidigm公司开发出了商品化的数字阵列PCR芯片 ，用实时PCR仪进行核酸扩增和定量检测。这种数字PCR芯片涉及到一种基于多层软光刻工艺制备的PDMS弹性微阀，在这种结构中，许多并行的串联着的反应小室位于上层PDMS中；控制通道网络位于下层PDMS中，由许多与上层反应小室网络相互垂直的通道组成。这种阀在没有外力的作用下处于开放状态，当给控制通道网络施加压力（如气压或水压）时，位于上下层之间的PDMS薄膜向上扩展，阀处于关闭状态，使得上层并行串联的反应小室被阻隔成若干个独立的反应室。

上述的数字PCR芯片已经被应用在检测血浆和肿瘤组织中的微量突变分子、评价等位基因的失衡和检测环境中的细菌、病毒等多个生物科学研究领域，并被预测为未来癌症早期诊断的主要技术。但是，这种基于PDMS弹性微阀的数字PCR芯片的制作涉及到多层结构的对准、封接，制备过程周期长而复杂。由于所采用的检测器件是高精密度数码CCD，整个商品化的芯片及配套仪器都非常昂贵，而且操作复杂，有的需要特殊的仪器，价格昂贵，难以进入普通的实验室，更难以作为常规的健康普查方法来推广。因此，从数字PCR芯片技术的大规模应用前景来看，目前的这种制备方法及应用成本均是不利的。

发明内容