[发明专利]猪圆环病毒2型Cap蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白及其制备方法，特别是指一种使用基因工程手段在家蚕中生产制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白及其方法，属于基因工程领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属圆环病毒属，是一种二十面对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可将PCV分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。其中，PCV1对猪无致病性，PCV2对临床危害很大，它可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征及先天性震颤等多种疾病的爆发，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。研究发现，PCV2含有11个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，ORF1和ORF2为最主要的两个阅读框。现已证实ORF2为编码病毒的主要结构蛋白和衣壳蛋白(Cap)，Cap蛋白上存在抗原表达位点，具有免疫原性，是PCV2特异性血清学检测方法和亚单位疫苗、核酸疫苗的基础。

普莱柯生物工程股份有限公司的发明CN 101920012 A公开了一种家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)为载体，通过转移载体中的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因同源重组的方式将猪圆环病毒2型Cap蛋白基因整合至家蚕核型多角体启动子下进行目的蛋白表达，可以获得PCV2 Cap蛋白的大规模表达，制备成含有重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的亚单位疫苗。但该方法需要通过使用BmNPV与AcNPV共转染并通过噬斑筛选的方法，获得含PCV2 Cap蛋白的重组家蚕核型多角体病毒，而BmNPV与AcNPV同源重组的几率低，噬斑筛选存在工作量大、成功率低的缺点；此外，噬斑筛选需要培养家蚕细胞，需要含胎牛血清(FBS)的TC-100培养基，且培养周期较长(一般为7-8天)。因此，该噬斑筛选方法存在工作量大、试验成本高、试验周期长的缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法，包括以下步骤：

(1).克隆猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组转移载体；

(2).将上述重组转移载体转化入含有病毒穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得含有猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因的重组穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；

(3).重组昆虫杆状病毒注射感染家蚕幼虫或蚕蛹；

(4).回收获重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；

(5).分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(1)中猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码序列包含序列表中的SEQ ID NO1。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码的基因的表达受多角体启动子的控制。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫杆状病毒包括昆虫核型多角体病毒。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤(2)中所述的昆虫细胞包括Sf9细胞。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中步骤

(3)中所述的家蚕品种包括欧洲种：Luobendihong、Baohuang、Hungary；中国种：Dazao、Qiansanmian、Datuanyuan、Ankang、Lan 5；日本种：Ri110、Dongfei、Su16、Su14、YingHXZ、Haoyue等。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白序列包含序列表中的SEQ ID NO2。

优选地，本发明的生产猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法中，步骤(3)中所述的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白为如下三种多肽的任意一种：

1)含有序列表中的SEQ ID NO2序列的多肽；

2)与1)所述多肽至少80％同源的多肽；

3)1)和2)所述多肽的免疫原性部分。