[发明专利]一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法。

背景技术

传统化石资源的大量开采和使用，带来温室效应、气候恶化的同时，化石资源匮乏引发的能源危机也日益突出。为了缓解目前的能源危机和环境问题，生物柴油作为化石能源的替代品已经成为国际上的热点。陆生高等植物油脂、废餐饮油以及动物油脂都可以作为制备生物柴油的原料，但它们的供应量是非常有限的，就算把它们加起来也难以满足人类对燃油的需求。异养微藻能在有限的土地上全年连续高密度生长，并可在一定条件下将无机碳和有机碳转化为藻体内大量贮存的油脂，而被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。

虽然产脂微藻是目前最好的生物柴油工业生产来源，但它的含油量不高，导致大规模培养微藻生产油脂成本昂贵，最终使得利用微藻制备生物柴油难以获得经济效益，产业化进程减缓。提高微藻细胞的油脂含量是目前降低成本的关键，有望从根本上解决生物柴油产业成本过高的瓶颈问题。因此，一直需要努力不懈的研究，以开发出产脂量及生物量更高的优良藻株，为单细胞油脂及生物柴油的工业生产提供具有竞争力的原材料。

为了提高微藻细胞的产脂量，过去的研究主要集中在以下几个方面：(1)培养基优化；(2)培养过程控制；(3)代谢工程方法改造藻株；(4)诱变选育高脂突变株。前两种方法虽然可在一定程度上有效促进藻细胞的产脂量，但提高的百分比数有限(通常提高20％以下)，仍无法满足产业化规模开发的要求。代谢工程方法改造微藻是解决藻细胞脂含量低的根本方法，需要全面考虑藻株的整体代谢网络的结构和调控特点，有待进一步进行研究，研发成本较高。

诱变育种方法研发成本低，选育周期短，是提高微藻细胞产脂量的有效途径。诱变育种方法的探索过程中，国内外科技工作者们发明了多种诱变手段(如物理诱变、化学诱变、物理化学复合诱变、多轮诱变等等)，以及多种高通量快筛高脂突变株的方法(如尼罗红染色法、磷酸香草醛法、称重法等等)，但也存在一些不足之处，如高脂突变株的筛选是盲目的、非定向的，往往是高脂突变株、低脂突变株、变化不显著的突变株藻落同时出现，无法区分，检测后才能根据结果进行确认，不可避免的造成人力、物力、财力的浪费，并增大工作量。理论上讲，从诱变处理后的藻株中，选育耐受脂合成抑制剂的微藻突变株可作为一种有效的手段，实现高脂突变株的定向筛选，避免盲目性，再结合以高通量的产脂量确认方法进一步验证，无疑将会以最节约的成本、最快的时间和最小的工作量选育出产脂量增强显著、可稳定遗传的微藻新品系。

发明内容

本发明目的在于提供一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种异养微藻的高脂突变株定向选育方法：

1)将在Kuhl培养基中培养至对数生长期的小球藻，或其它具有暗异养生长特性的产脂微藻株系，采用EMS化学诱变处理；将具有暗异养生长特性的产脂微藻株系(小球藻)，接种到Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m^-2 s^-1连续光照的摇床中振荡培养至对数生长期，在培养至对数生长期的每毫升藻体内加入10-100μl EMS溶液，在黑暗条件下以18-35℃处理15-180min，而后加入EMS溶液等体积的硫代硫酸钠溶液终止诱变反应；

所述Kuhl培养基为：10g/L葡萄糖、1g/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9.3mg/LEDTA、6.9mg/L七水硫酸亚铁、14.7mg/L二水氯化钙、0.29mg/L七水硫酸锌、0.17mg/L一水硫酸锰、0.06mg/L硼酸、0.002mg/L五水硫酸铜、0.012mg/L四水钼酸铵，pH 6.5。

2)将步骤1)诱变处理后藻体转接培养在高脂定向筛选平板上，筛选出体积增大的单细胞藻体进行扩种继代培养；即将诱变处理后藻体洗涤后观测其细胞浓度，根据细胞数将藻体稀释10³-10⁶倍，分别涂布到高脂定向筛选平板上，置于18-35℃的程控恒温培养箱中无光静置培养，筛选单细胞体积增大的藻体于Kuhl培养基中，在温度为18-35℃，转速为100-200rpm，光照强度为20-150μmol m^-2 s^-1连续光照的摇床中振荡扩种继代培养至对数生长期。