[发明专利]一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物免疫学研究技术领域，具体涉及一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法。

背景技术

对于鱼类整个免疫系统以及免疫应答规律等的基础研究，都依赖于对免疫球蛋白的研究，它是鱼体免疫应答的主要介质。因此对免疫球蛋白的研究也是鱼类免疫学研究的重点和热点。这其中如何使鱼体发生免疫应答以及如何获得高纯度的免疫球蛋白是研究的关键。在大菱鲆免疫研究中，以往主要采用将病原制成疫苗免疫鱼体，使之产生特异性抗体，然后通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤等技术对抗体进行纯化，来研究免疫球蛋白的特性。但通过这些方法获得的免疫球蛋白，其活性、纯度以及数量都是有限的，而且操作步骤较为繁琐，不利于深入、精确的研究免疫球蛋白的特性及其发生机理。究其原因主要是：一方面，以病原作为抗原，其结构复杂，性状不稳定，变种多，产生的抗体含有不确定性因素较多；另一方面，目前常用的免疫球蛋白纯化方法操作较为繁琐，在纯化过程易损失蛋白。因此，在大菱鲆免疫球蛋白的研究过程中，长期以来一直未能找到合适的抗原来获得抗体，一定程度上限制了免疫球蛋白研究的发展，致使诸如大菱鲆免疫球蛋白的类型、数量、基因、应答机理、调控机理等方面的研究不能深入。因此，有必要寻找一个结构简单、稳定、易获得且价廉的优质抗原激起大菱鲆鱼体免疫应答反应，再通过此抗原耦合的亲和层析柱纯化免疫球蛋白，操作简单，获得的免疫球蛋白纯度高，利于对其进行深入的研究和探讨。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，能够有效解决大菱鲆的免疫研究中缺乏有效的抗原，特异性免疫球蛋白数量不足的问题。

申请人在长期的研究中发现牛血清白蛋白BSA能有效的诱使大菱鲆发生免疫反应，并通过创造性劳动后建立了具体的免疫方法。

本发明的用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征是利用牛血清白蛋白(BSA)作为抗原来免疫大菱鲆。

本发明的免疫方法，包括如下步骤：

1)第一次免疫：将BSA与弗氏完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5ml/kg鱼体重肌肉注射健康大菱鲆；

2)第二次免疫：第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆；

3)第三次免疫：第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混匀乳化制成疫苗，以0.5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起1～10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。

优选采用免疫后8～10周的高效价血清，通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。

所述的亲和层析的方法，具体操作如下：将BSA-琼脂糖装入10×0.5cm层析柱中，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液预洗后，将大菱鲆免疫血清与等体积磷酸盐缓冲液混合，过滤后上层析柱，PBS洗涤；用10ml洗脱液将大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白洗脱下来并作为单一组分收集；立即用1.2ml 0.1mol/L Tris-HCl中和；置0.01mol/L磷酸缓冲液中4℃透析获得大菱鲆免疫球蛋白。

上述的洗脱液为含0.15mol/L NaCl的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液，洗脱液pH值为11.0。

本发明克服了生化领域对BSA的惯常用法，将其作为抗原经过特定的免疫程序来免疫大菱鲆，从而获得高效价的抗BSA特异性抗体。本发明的方法解决了长期以来大菱鲆免疫研究缺乏足够特异性免疫球蛋白的难题。同时采用的BSA具有结构简单，成分单一，不易对免疫结果产生干扰，而且易获得等优点。在水产动物中可建立以BSA为模式蛋白，并形成以BSA为基础的研究模式。

附图说明

图1：间接ELISA法测定BSA免疫大菱鲆后血清抗体效价的变化图。

图2：SDS-PAGE初步分析应用不同方法纯化的免疫球蛋白效果对比图。其中箭头所示位置为免疫球蛋白的重链(上端)和轻链(下端)，M-marker、1、辛酸-(NH4)₂SO₄沉淀法纯化的免疫球蛋白；2、根据等电点进行透析纯化的免疫球蛋白；3、在第2步基础上，过sephadex-G200凝胶柱，纯化的免疫球蛋白；4、免疫亲和层析法纯化的特异性免疫球蛋白。

具体实施方式