[发明专利]一种批量基因克隆的方法

权利要求书

1.一种批量基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，提取克隆群体中每个个体与两个亲本基因组一起高通量测序，并进行基因组初步直接组装；对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点；按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比；通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点或隐性池候选位点富集后重测序，在隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。

2.根据权利要求1所述的批量基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建基因克隆群体：选择多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本通过杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体；

(2)确定候选位点：分别提取克隆群体中每个个体和2个亲本基因组DNA，按高通量测序流程构建文库，PCR并高通量测序；按直接组装，初步构建克隆群体中每个个体和2个亲本的全基因组序列；按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比；通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，该等位位点为目标性状的候选位点；

(4)目标位点的确定：当候选位点超过50个时，通过杂交或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；当候选位点不足50个时，采用普通PCR、实时PCR、高通量PCR或测序技术的检测方式，逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点，没有出现的显性座位的等位位点即为目标位点；

(5)基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

3.根据权利要求1所述的批量基因克隆的方法，其特征在于，所述亲本杂交构建分离群体是利用遗传距离近的纯系亲本。