[发明专利]贪噬菌CGMCC4969及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969 及其产生的腈水合酶基因簇应用于3-氰基吡啶生物转化为烟酰胺。 

背景技术

腈水合酶(nitrile hydratase，EC.4.2.1.84)(简写为NHase)催化腈化物水合生成相应的酰胺类化合物。来源于微生物的腈水合酶具有反应条件温和、产率高、副产物少、区域和立体选择性强等优点，已成功应用于医药、农药及其中间体、食品与饲料添加剂等精细化学品的生产，并显示出巨大发展潜力。 

目前报道的产生腈水合酶的微生物有：根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens d3、节杆菌Arthrobactersp. J-1、蜡状芽孢标杆菌Bacillus cereus、芽孢杆菌Bacillus sp. BR 449、史氏芽孢杆菌Bacillus smithii SC-J05-1、短杆菌Brevibacterium imperialis CBS 489-74、诺卡氏菌Nocardiasp. 108、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis B23、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM 3095、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous J1、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous R312、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous LL 100-21、红平红球菌Rhodococcus erythropolis BL1、玫瑰红红球菌Rhodococcus rhodochrous A4、红球菌Rhodococcussp. AJ270、红球菌Rhodococcussp. SHZ-1、红球菌Rhodococcussp. ZJUT-N595、红球菌Rhodococcussp. N 774、高里假丝酵母Candida guilliermondii CCT 7207、著明假丝酵母Candida famata、黄隐球酵母Cryptococcus flavus UFMG-Y61（郑裕国等，腈转化酶在精细化学品生产中的应用，生物工程学报，2009，25 (12): 1795-1807）。对贪噬菌属Variovorax产生的腈水合酶而言，目前在Genbank数据库中有Lourenco等提交的224bp来源于Variovorax sp. DSM 11402的部分腈水合酶基因片段（genbank登录号：AJ577856）；来源于V. paradoxus EPS（Genbank登录号：NC_014931）和V. paradoxus S110（Genbank登录号：NC_012791）两个菌株的全基因组序列中的腈水合酶基因，然而上述腈水合酶基因均为生物信息学预测结果，未有实验证明其腈水合酶功能。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能产生腈水合酶的菌株及其在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用；以及从该菌株中克隆腈水合酶基因簇并在E. coli BL21（DE3）中诱导表达；重组表达菌株在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。本发明的基本原理如图1所示。 

申请人筛选到一株命名为J1的菌株，该菌株可生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。从该菌株中克隆出完整的腈水合酶α和β亚基基因簇，其碱基由序列表中SEQ ID No：1组成。将由SEQ ID No：1组成的DNA重组于pET28a质粒上，重组质粒pET28a-NHase电转化至E. coli BL21（DE3）菌株中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，含表达腈水合酶的E. coli BL21（DE3）菌株可转化3-氰基吡啶生成烟酰胺，而不含腈水合酶基因的对照菌株不能转化3-氰基吡啶为烟酰胺。 

本发明所提供的菌株J1为一种贪噬菌V.boronicumulans，该菌株现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 4969 。