[发明专利]检测藤黄绿菌素和吩嗪类化合物的反相液相色谱方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种反相液相色谱检测方法，具体涉及的是一种检测藤黄绿菌素和吩嗪类化合物的反相液相色谱方法。

背景技术

藤黄绿菌素（Plt）与吩嗪类化合物是假单胞菌的两类主要代谢产物。Plt是一种芳香族聚酮类抗生素，能抑制细菌、真菌，特别是抑制卵菌属真菌，是一种具有广泛应用前景的新型生物农药。吩嗪类化合物是对含有吩嗪结构的一类物质的总称，包括吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid, PCA）、2-羟基-PCA（2-hydroxy-PCA，2-OH-PCA）、1-羟基吩嗪（1-hydroxyphenazine，1-OH-PHZ）、2-羟基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ）和绿脓菌素（pyocyanin，PYO）等，研究表明，吩嗪类化合物几乎均具有抑制病原菌的生物活性，并根部定植及根际竞争存活方面具有重要的作用。

反相液相色谱是液相色谱中具有高柱效和分离力的检测技术, 采用以表面非极性载体为固定相，以极性大于固定相极性的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，利用样品中各组分和疏水基团之间疏水作用的差异而对混合物进行分离。

目前常用的抗生素检测技术主要为高效液相色谱法和毛细管电泳法。例如，高斌等(Analytical Letters，2010，43，12:1823-1833)提供的方法，其中Plt、PCA和1-OH-PHZ的最低检测限仅为0.107、0.021、11.56μg/mL，灵敏度较低。

发明内容

    本发明的目的在于提供一种检测藤黄绿菌素和吩嗪类化合物的反相液相色谱方法，采用常规的反相液相色谱方法进行检测，该方法中流动相为5～40mM的乙酸铵-乙腈体系，洗脱条件为体积分数为5%～100%乙腈的梯度洗脱。

优选地，所述流动相为10～30mM的乙酸铵-乙腈体系，洗脱条件为用体积分数为8%～80%乙腈进行梯度洗脱。

优选地，所述流动相为15～25mM的乙酸铵-乙腈体系，洗脱条件为用体积分数为15%～70%乙腈进行梯度洗脱。

优选地，所述流动相的流速为0.5～1.0mL/min。

优选地，所述方法中采用的检测波长为190～400nm。

优选地，所述反相液相色谱方法采用的色谱柱内径为4.6mm、长度为25cm，柱温为23～28℃。

本发明还涉及一种用于检测藤黄绿菌素和吩嗪类化合物的反相液相色谱用试剂盒，包括乙酸铵、乙腈和超纯水。

本发明还涉及一种用于检测藤黄绿菌素和吩嗪类化合物的反相液相色谱系统，包括：高效液相色谱仪及其工作站，色谱柱，乙酸铵-乙腈流动相体系。

本发明的有益效果如下：本发明的方法能够分别或者同时检测藤黄绿菌素、吩嗪类化合物，如PCA，PYO，1-OH-PHZ，2-OH-PCA，2-OH-PHZ等等；本发明的方法灵敏度较高，最低检测限为0.006～0.1μg/mL, 最低定量限为0.02～0.3μg/mL；当待检物质在2～100μg/mL之间时，本发明的方法标准曲线的线性相关系数大于0.9900。同时，本发明的方法也可用来分离藤黄绿菌素、吩嗪类化合物。

具体实施方式

就以下针对的本技术的特定实施方式或者特定用途的说明而言，这些说明仅为示范性质的，并且仅仅提供示例实施方式的简要描述。因此，本发明并不局限于以下所述的具体实施方式，而是相反，本发明包括落入附带的权利要求书的真实范围内的全部替代方案、改进方案以及等同方案。

以下实施中使用的反相液相色谱分析设备为1260 Infinity高效液相色谱仪（Agilent Technologies Group）及其工作站，内径为4.6mm的C18色谱柱，长度为25cm (Kromasil)。常规的反相液相色谱方法相关步骤可参见《于世林，苗凤琴. 分析化学[M].北京：化学工业出版社，2006.346～384》。

实施例1、标准曲线的测定

1、原材料

甲醇(HPLC级)；三蒸水（电导率为0.082μS/cm）。

2、分析样品的制备

（1）分别配制2、5、10、25、50、75、100μg/mL的浓度梯度的PCA（吩嗪-1-羧酸），PYO（绿脓菌素），1-OH-PHZ（1-羟基吩嗪）与Plt（藤黄绿菌素）的甲醇溶液；