[发明专利]一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法

权利要求书

1.一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养30～37天，获得幼苗；

二、将长度为2cm的幼苗接种到添加7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养1～3个月，获得无菌苗；

三、取无菌苗的新生嫩叶剪切成直径1cm的圆片，然后接种到添加2.0mg/L2，4-D、0.15mg/L激动素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养5～28天，获得愈伤组织，再更换新鲜培养基进行继代培养，经过5～6次继代培养后，将愈伤组织转接到MS培养基中，在25℃、60r/min、每10天更换新鲜的MS培养基条件下摇瓶继代培养4周，获得不定芽；

四、将形成的不定芽连同基部的愈伤组织一起切下，然后接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株，长度为4～5cm；

五、将小植株从基部切下，然后在10mg/L激动素中浸泡小植株基部，再接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株，即完成黑水缬草愈伤组织再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中冷冻预处理的过程为：将健康饱满的种子用自来水冲洗5遍，用滤纸吸掉表面水分，然后置于培养皿中，于-4℃条件下保存1周。

3.根据权利要求1所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中消毒的过程为：将冷冻预处理后的种子在室温中用无菌水浸泡过夜，在无菌台中用无菌水涮洗5次，然后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，将种子包裹于小块无菌纱布中，浸泡在体积浓度为75％的乙醇中浸泡1min，然后无菌水清洗2次，再置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡5min，随后用无菌水清洗5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养35天，获得幼苗。

5.根据权利要求4所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤二中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养2个月，获得无菌苗。

6.根据权利要求5所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤三中在温度为25℃、湿度为65％、每天光照16h的条件下培养7天，获得愈伤组织。

7.根据权利要求6所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤四中在温度为25℃、湿度为60％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株。

8.根据权利要求7所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤五中在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株。