[发明专利]利用酵母表面展示系统分析单抗的抗原表位的方法及其在疫苗开发中的应用

权利要求书

1.分析目的蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤：

(1)构建所述目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；

(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库甲；

(3)将所述目的蛋白的单克隆抗体与所述酵母展示文库甲混合，分选出与所述单克隆抗体结合的酵母；

(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸序列分析所述目的蛋白的抗原表位。

2.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在进行所述步骤(1)前，先通过PCR扩增所述目的蛋白的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为高保真DNA聚合酶；优选为PyroBest DNA Polymerase。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述T载体为在pCTCON2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表5自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTCON2-T质粒；所述目的蛋白的编码基因的DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒的Xcm I酶切位点；所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，构建所述DNA文库的方法包括如下步骤：

①将所述目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50-100bp的DNA片段；

②将步骤①回收的DNA片段进行随机片段重组；

③将步骤②重组后的DNA片段加A尾；

④将步骤③得到的加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒的Xcm I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，利用流式细胞术进行步骤(3)中的所述分选。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤：

①提取所述步骤(1)中得到的含有所述DNA文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母甲；

②收集所述重组酵母甲诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库甲；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。

7.如权利要求3至6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：

(5)构建所述步骤(4)分析获得的所述抗原表位的编码序列的DNA突变文库；所述DNA突变文库中，所述抗原表位的编码序列的突变DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒；

(6)将所述DNA突变文库展示在所述酵母表面，得到酵母展示文库乙；

(7)将所述目的蛋白的单克隆抗体和C-myc单抗一起与所述酵母展示文库乙混合，分选出与C-myc单抗结合且与所述目的蛋白的单克隆抗体不结合的酵母；

(8)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述pCTCON2-T质粒的DNA片段的核苷酸序列与所述抗原表位的编码序列的差异分析蛋白的抗原表位。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述步骤(5)中，构建所述DNA突变文库的方法包括如下步骤：①通过PCR扩增所述抗原表位的编码基因；所述PCR扩增所用的酶为低保真DNA聚合酶；优选为rTaq酶；②将所述PCR扩增产物插入所述pCTCON2-T质粒的Xcm I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA突变文库；

所述方法中，利用流式细胞术进行步骤(7)中的所述分选；

所述步骤(6)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤：①提取所述步骤(5)中得到的含有所述DNA突变文库的质粒，转化所述酵母，得到重组酵母乙；②收集所述重组酵母乙诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库乙；所述诱导是通过向培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。

9.权利要求1至8中任一所述方法在研究抗原和抗体相互作用中的应用。

10.权利要求1至8中任一所述方法在疫苗研发中的应用。