[发明专利]犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因质粒及其构建、表达方法，即构建犬CaIFN-α表达质粒及其在抗辐射菌中表达犬CaIFN-α的方法。

背景技术

近年来，犬类动物作为伴侣动物、警犬及救护犬等在人类的生活中越来越占据重要的地位。但各种病毒性疾病困扰着中国的养犬业，一方面对于病毒学传染病，目前还没有一种特效的治疗药；另一方面，狂犬病、犬细小病毒病等人畜共患病病原的发生给人类带来了不小的危害，已引起全社会的关注。因此，从兽医和人医临床角度出发，综合控制犬病毒性疾病，需要安全、有效、副作用少的药物，而犬的α干扰素具有广谱的抗病毒作用，具有很高的研究及临床应用价值。犬的α干扰素(CaIFN-α)全基因为561个碱基，编码187个氨基酸，蛋白分子量约为19kDa，具有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用。有关犬CaIFN-α的表达，曾采用大肠杆菌、酵母、哺乳动物培养细胞及家蚕幼虫表达等方法，但分别存在着以下缺点：大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作，酵母表达中质粒转化体不稳定，哺乳动物培养细胞生产的成本太高，而家蚕幼虫表达又受季节限制、不能周年生产。所以迫切需要有一种操作简单、表达效果好、并适于大规模表达生产犬CaIFN-α的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种犬CaIFN-α的表达质粒及其构建方法，以及利用抗辐射菌表达生产犬CaIFN-α的方法。

本发明的这种犬CaIFN-α的表达质粒是：以抗辐射菌-大肠杆菌间的穿梭载体为基础，与抗辐射菌Deinococcus radiodurans由来的具有活性的groEL启动子及犬CaIFN-α基因片段重组，构建成具有CaIFN-α表达活性的质粒，并以抗辐射菌Deinococcus grandis为宿主，-射线辐照诱导等，高效表达生产具有生物活性的犬CaIFN-α。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案及其步骤如下：

(1)穿梭载体质粒的构建

用QIAfilter Plasmid kit(Qiagen)从抗辐射菌Deinococcus radiopugnans中提取质粒pUE30并进行Sph I酶切，用Sph I消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Deinococcus radiodurans中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT，再与上述pUE30的Sph I消化物混合，用DNA连接酶连接，采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒的株，获得穿梭载体质粒pZT29。

(2)CaIFN-α基因的克隆

以浙江省地方家犬的血淋巴细胞抽提的基因组DNA为模板，利用RT-PCR技术扩增得到犬CaIFN-α基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagen的PCR纯化试剂盒纯化犬CaIFN-α基因。

(3)CaIFN-α基因表达质粒的构建

设计包含限制性内切酶Cla I位点的DNA损伤修复基因rec A的groEL启动子的引物，PCR增幅groEL启动子，在上述穿梭载体质粒的Cla I酶切位点插入groEL启动子构建得到转化子pZT66。

进一步用限制性内切酶EcoT221消化上述转化子pZT66，用T4DNA polymerase(Takara)进行DNA片断末端的平滑化，将上述纯化的犬CaIFN-α基因顺向插入上述质粒的EcoT221位点，形成CaIFN-α基因的表达质粒。

(4)CaIFN-α的获得

用构建的犬CaIFN-α基因的表达质粒转化Deinococcus grandis，得到具有表达犬CaIFN-α基因的菌株。上述得到的重组转化子在TGY培养基中30℃培养，然后进行一定剂量-射线照射，再继续培养，使菌体在接受外界刺激后，大量合成犬CaIFN-α。

在本发明中，步骤3)中的引物如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4(即序列3和序列4)。

在本发明中，步骤4)的辐射诱导条件如下：

1)菌体辐射诱导的时期：菌体生长到36-48h，即稳定早期，菌浓度10⁷-10⁸个/ml，菌体形态多数呈二联体，此时是进行辐射诱导的最佳时期；