[发明专利]高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备

权利要求书

1.一种高活力磷脂酶D，其特征在于：高活力磷脂酶D的氨基酸序列是通过分别使如序列7的核苷酸序列编码的野生型磷脂酶D氨基酸序列中Glu69、Ser285的氨基酸位点替换，得到如序列8的核苷酸序列，序列8经在毕赤酵母细胞表面高效表达后获得高活力磷脂酶D。

2.根据权利要求1所述的高活力磷脂酶D，其特征在于：所述野生型磷脂酶D来源是色褐链霉菌AS 4.331。

3.一种细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于：其构建过程包括以下步骤：

(1)定点突变野生型磷脂酶D的成熟肽基因，得到高活力磷脂酶D基因；

(2)将高活力磷脂酶D基因序列与载体相连，得到携带高活力磷脂酶D基因的重组载体；

(3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母中，得到细胞表面展示磷脂酶D的毕赤酵母工程菌。

4.根据权利要求3所述的细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述的重组载体为毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo。

5.根据权利要求3所述的细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。

6.一种细胞表面展示高活力磷脂酶D的毕赤酵母全细胞催化剂，其特征在于：使用的酵母工程菌为细胞表面展示磷脂酶D酵母工程菌。

7.根据权利要求6所述的细胞表面展示高活力磷脂酶D的毕赤酵母全细胞催化剂，其特征在于：制备过程包括以下步骤：

(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h，以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃、250r/min培养24h，然后在4℃、8000r/min离心10min得到菌体，转入BMMY培养基中，30℃、250r/min培养5d，每隔24h加入终浓度为0.5％V/V甲醇诱导产酶。

(2)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗2次，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。