[发明专利]3-氯代酪氨酸翻译系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2、3、4所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种3-氯代酪氨酸(3-Cl-Tyr)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-氯代酪氨酸掺入目标蛋白质的3-氯代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中掺入3-氯代酪氨酸的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-氯代酪氨酸的突变蛋白质。

背景技术

生物体氧化应激状态产生的活性物质一方面可以起到防御和免疫作用，另一方面会对自身蛋白造成氧化损伤，其中蛋白酪氨酸残基氯代是一种常见的氧化修饰，目前已知这种氧化修饰与帕金森氏病，哮喘，动脉粥样硬化，急性心肌梗死等疾病密切相关(Choi DK，Pennathur S，Przedborski S，et al.J Neurosci 2005，25(28)：6594-6600；Aldridge RE，Chan T，Kettle AJ，et al.Free Radic Biol Med 2002，33(6)：847-856.)。载脂蛋白ApoA1是高密度脂蛋白主要成分，介导胆固醇从血管壁到血液反向传输。ApoA1 192位酪氨酸是髓过氧化物酶氯代修饰的主要位点，在动脉粥样硬化患者中发现有高水平的ApoA1氯代(Heinecke JW.Am J Cardiol 2003，91(3A)：12A-16A.)。目前研究ApoA1氯代与功能主要采用位点突变和氧化剂氧化的方法，除了192位酪氨酸可以被氯化，其它氨基酸和位点也可以被氧化。从而使目前ApoA1氧化与功能损伤机理仍然存在争议(Shao B，Bergt C，Heinecke JW，et al.J Biol Chem 2005，280(7)：5983-5993；Peng DQ，Wu Z，Brubaker G，Smith JD，et al.J Biol Chem 2005，280(40)：33775-33784.)。

另一方面，生物体内有一些酸性的环境，如溶酶体(lysosome)，以及与溶酶体相关的自噬体(autophagosome)及抗原呈递过程中的吞噬酶体(phagolysosome)，它们内部pH低于6，在4-5左右。目前用来标记这类酸性细胞器主要使用EGFP-LC3载体(Ni HM，Bockus A，Ding WX，et al.Autophagy，7(2)：188-204.)。但是当EGFP进入酸性细胞器内部，会引起488nm激发荧光减弱。目前通过引入红色荧光蛋白mRFP来标记自噬体(Kimura S，Noda T，Yoshimori T.Autophagy 2007，3(5)：452-460.)。由于mRFP pKa为4.5，在600nm处发红光，在自噬体中不影响其荧光亮度。

虽然目前有红色荧光蛋白dsRed pKa 4.3(Baird GS，Zacharias DA，Tsien RY.Proc Natl Acad Sci U S A 2000，97(22)：11984-11989.)，青色荧光蛋白ECFP pKa 4.7(Patterson G，Day RN，Piston D.J Cell Sci 2001，114(Pt5)：837-838.)，但是目前使用的绿色荧光蛋白EGFP pKa 6.0，黄色荧光蛋白YFP pKa 5.6均不太适合标记溶酶体等酸性细胞器，而研究细胞内蛋白与蛋白相互作用，以及多种蛋白的动态情况，往往需要多种不同颜色的荧光蛋白来标记。