[发明专利]采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法。

背景技术

烟草是全世界最主要的经济作物之一，中国的种植面积居世界首位，每年为国家增加财政收入2000～3000亿元。然而，随着产业的发展和种植面积的不断扩大，20世纪70年代以后，烟草病毒病危害逐年加重。在烟草田间，常表现为多种病毒混合侵染，给烟草生产造成重大损失，重病田减产20％-50％，夏烟减产70％以上，并呈现出随栽培品种的单一化及栽种面积的不断扩大而逐步加重的趋势。

危害中国的烟草病毒主要有黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)、烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco Vein BandingMosaic Virus，TVBMV)等十几种病毒。其中CMV、PVY、TEV、TMV和TVBMV危害最严重，可影响烟叶的产量和质量，造成重大经济损失。

目前烟草病毒病日益呈现复合侵染的趋势，对危害烟草的病毒进行有效和快速检测在预防和控制烟草病毒病上具有十分重要的现实意义。准确灵敏的病毒检测方法是植物病毒防治的基础。目前普遍采用的检测方法主要有指示植物法、电镜技术、免疫学技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalmplification，LAMP)是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列(Notomietal，2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据烟草病毒的外壳蛋白基因保守区设计了LAMP引物，采用一步法反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测烟草五种主要病毒的方法。为烟草病毒的快速检测提供了新的手段。

发明内容

本发明提供了一种采用反转录环介导等温扩增技术检测烟草病毒的方法，其中该方法包括烟草病毒总RNA提取，RT-LAMP反应和电泳检测，确定病毒种类，其中烟草病毒选自黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)中的2种或2种以上，优选地引物组包含如下5组引物中2组或2组以上引物的引物组：

第1组引物，用于CMV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.1：5’-TCTACCGTGTGGGTGACA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GAGCACGGCGTACTTTCG-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.3：5’-CCGTCCGCGAACATAGCAGAG-GTCCGTAAAGTTCCTGCCTC-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GCTGCATCTGGAGTCCAAGCC-TGTCGCCAATATCAGCGC-3’；

第2组引物，用于PVY病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：

SEQ ID NO.5：5’-CGCGCTATGCCTTTGACTT-3’；

SEQ ID NO.6：5’-TTGGAGAGACATCCTCGGT-3’；

内引物(FIP和BIP)：

SEQ ID NO.7：5’-CAATGCTGCGGCCTTCATTTGA-GGTCACATCACGAACACCAG-3’；

SEQ ID NO.8：5’-TCAGCCCAACCTCGACTTTTCG-GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT-3’；

第3组引物，用于TEV病毒的RT-LAMP反应：

外引物(F3和B3)：