[发明专利]一种Exendin-4类似物

权利要求书

1.一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp，其中Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的氨基酸序列为：

Pro-Pro-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Asp(SEQ ID NO：1)。

2.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp，其特征在于：该类似物分子量为4116.4Da，Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp N端添加的2个脯氨酸(Pro)可以与融合伙伴的C端天冬氨酸(Asp)形成酸水解位点，在盐酸作用下可以断开；Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的C端截掉Exendin-436-39位氨基酸的Pro-Pro-Pro-Ser刚性结构，并添加一个Asp，形成的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp类似物表达量较高且依然能保持显著的生物活性，能够有效降低血糖而不引起低血糖，并且具有促进胰岛β细胞分泌胰岛素的能力。

4.一种载体，其特征在于：它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求3所述的重组方法：将Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp基因与本实验室构建的5#载体上的融合伙伴的DNA片段连接，构成新的融合蛋白基因。该融合蛋白基因位于5#载体T₇启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称5#-Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。

5.一种基因工程菌，其特征在于：含有权利要求4所述的载体。

6.包括权利要求4所述的该类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的重组方法，其特征在于：该融合伙伴与活性多肽之间以Asp-Pro-Pro-连接，这种连接对酸敏感。

7.一种Exendin-4(1-35肽)类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(I)在适合的表达条件下，权利要求5所述的宿主菌。

(II)通过溶菌，洗涤，乙醇沉淀等方法，分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp与融合伙伴C末端组成的融合蛋白；用酸水解方法切割融合蛋白，形成权利要求1所示的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp的氨基酸序列。

(III)通过QAE-Sehadex A-50分离出Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的步骤(III)中的Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp肽进入体内后，被体内丰富的二肽基肽酶IV及PPCE酶迅速切掉Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp N端的Pro-Pro-，形成Exendin-4(1-35)-Asp，这对于研制抗二肽基肽酶IV降解的长效激素是有益的。

9.根据权利要求1所述的Exendin-4类似物的活性，其特征在于：所述的Exendin-4类似物Pro-Pro-Exendin-4(1-35)-Asp依然具有以葡萄糖浓度依赖方式降低血糖而不引起低血糖，促进胰腺胰岛β细胞分泌胰岛素作用，且作用效果显著，有望用于治疗二型糖尿病。