[发明专利]人STAT3基因SiRNA慢病毒载体及其构建方法

权利要求书

1.一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，包括：一段核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST，所述核苷酸序列含有针对人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM_139276；其特征在于，所述干扰靶序列SiRNA选自：SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4。

2.如权利要求1所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体，其特征在于，所述人STAT3基因SiRNA慢病毒载体包括含有所述干扰靶序列SiRNA的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列选自：

SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：12。

3.一种人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1：针对选自人STAT3基因mRNA序列的干扰靶序列SiRNA，所述人STAT3基因mRNA序列的Gene bank登录号为NM 139276，设计并合成含有干扰靶序列SiRNA的双链寡核苷酸序列，所述双链寡核苷酸序列选自：

1#：

SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6，或

2#：

SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8，或

3#：

SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10，或

4#：

SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12。

其中，所述干扰靶序列SiRNA分别对应于：

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；

步骤2：将步骤1中设计并合成的所述双链寡核苷酸序列退火后形成含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA，将所述含有干扰靶序列SiRNA的双链DNA插入到表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，转化感受态大肠杆菌DH5α后，测序，构建得到STAT3SiRNA干扰载体；

步骤3：将所述STAT3 SiRNA干扰载体亚克隆至pDONR221载体中，再与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组，构建得到人STAT3基因SiRNA慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA；

步骤4：将所述慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST/STAT3SiRNA转化感受态大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆进行测序鉴定，鉴定正确的克隆即为成功构建的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，进一步包括采用不对人类任何基因产生干扰的SiRNA双链作为阴性对照重复上述步骤1-2，所述阴性对照SiRNA双链和所选中的STAT3siRNA序列有相同的核苷酸组成，但没有明显的同源性，和细胞中其他基因也没有同源性。

5.根据权利要求4所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述阴性对照的双链寡核苷酸序列为：

NC：

SEQ ID NO：13与SEQ ID NO：14。

6.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤2进一步包括对所述STAT3SiRNA干扰载体进行干扰效果测定，筛选出干扰效率最高的干扰载体，用于步骤3。

7.根据权利要求6所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述STAT3SiRNA干扰载体的所述干扰效果测定包括实时定量Q-PCR技术与免疫印记法技术。

8.根据权利要求3所述的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤4进一步包括以所述成功构建的人STAT3基因SiRNA慢病毒载体与其相应慢病毒包装系统载体一起感染293T细胞48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行慢病毒滴度测定。