[发明专利]用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法，尤其涉及一种基于表皮角质细胞水平的用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法。

背景技术

因为皮肤保湿功能是皮肤护理类化妆品和皮肤保健产品的最基本功能，人们一直在寻找能够持水保湿/抗干燥的有效添加剂，因此建立方便快捷直观的评价方法尤为重要。目前，国内外对保湿相关产品功效评价多采用人体测试，而对于保湿相关的活性添加剂的功效评价手段单一，报道较多的体外方法只有称重法，即通过称取重量、计算吸湿率和保湿率来评价添加剂的保湿性。

MTT测定(噻唑蓝测定)是一种检测细胞活性的方法，是检测细胞增殖方面常用手段。其基本原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTT转变为不溶的紫色颗粒，后者的生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法，其特征在于，该方法包括以培养基培养细胞、细胞同步化、细胞铺板、加入药物、干燥和噻唑蓝(MTT)测定步骤，然后使用t检验和方差分析对实验结果进行统计学处理，p＜0.05，表示差异显著；所述干燥步骤按照如下方式进行：吸去培养基后，在干燥风速0.1m/s-1.0m/s、湿度为15％-50％和20-30℃温度下放置5min-20min。

本发明所使用的术语“细胞同步化”意指在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。

本发明所使用的术语“细胞铺板”意指将细胞悬液接种于细胞培养板的过程。

根据本发明的一个优选实施方案，所述细胞为人表皮角质细胞。

根据本发明的一个优选实施方案，所述培养基为MEM培养基(低限基本培养基)或RMPI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute培养基1640)。

根据本发明的一个优选实施方案，所述药物可以选自常见保湿剂如甘油、透明质酸钠和中草药提取物如银耳多糖等。

根据本发明的一个优选实施方案，加入药物后细胞孵育12h～48h。

根据本发明的一个优选实施方案，所述干燥步骤按照如下方式进行：所述干燥步骤按照如下方式进行：吸去培养基后，在干燥风速0.2m/s-0.6m/s、湿度为20％-40％和20-30℃温度下放置6min-15min。

根据本发明的一个更优选实施方案，所述干燥步骤按照如下方式进行：吸去培养基后，在干燥风速0.3m/s、湿度为35％和27℃温度下放置10min。

所述MTT测定步骤按照如下方式进行：细胞以含10％小牛血清的MEM培养基继续培养24h后，每孔加入MTT液，在5％CO₂、37℃下孵育4h后于570nm测定。

所述MTT液的浓度可以为0.5mg/ml，每孔加入量可以为500ul。

本发明是基于表皮角质细胞水平的用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法，其操作方便、可重复，并可通过客观的科学数据可以直观的反映被筛选物质的保湿/抗干燥损伤功效。

具体实施方式

实施例1：甘油体外保湿/抗干燥损伤功效的评价

1.1试验材料

细胞：人表皮角质细胞株HaCat

试剂：MEM培养基、0.25％胰酶、小牛血清、双抗、PBS(磷酸缓冲液)、MTT

材料及仪器：24孔细胞培养板、CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪、湿度计

1.2试验方法

1.2.1细胞培养

人表皮角质细胞以含10％小牛血清的MEM培养基正常培养，当细胞生长至融合率达80％以上时，去除培养基，用PBS洗一次，然后加入0.25％的胰酶消化，当细胞皱缩变圆时，倾去胰酶，加入含10％小牛血清的MEM轻轻吹打，收集细胞并离心，计数细胞，用MEM将细胞浓度调整至适当浓度接种至培养瓶中。待生长至融合率达80％以上时，进行下一次传代。

1.2.2细胞同步化

细胞生长至融合率达80％以上时，加入不含小牛血清的MEM培养基作同步化处理12h。

1.2.3细胞铺板

同步化后的细胞，0.25％胰酶消化，收集细胞计数，调整细胞浓度，接种至24孔培养板，1ml细胞悬液每孔，5％CO2，37℃培养过夜使贴壁。