[发明专利]海洋中含细菌叶绿素的微生物的定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物的定量方法，尤其是涉及一种基于时间序列观察、自动成像和数字化分析的落式荧光显微镜法的海洋环境中独特的含细菌叶绿素(Bchl.a)的微生物群的准确定量方法，

背景技术

含细菌叶绿素的微生物(BCM，Bacteriochlorophyll a Containing Microbes)是海洋环境微生物群落中一类具有特殊功能的组分，由于缺少有效的丰度计数用于构建其动力学数据，其生态功能还不是很清楚。好氧不产氧光合异养细菌(AAPB，Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria)是一类新近认识的BCM主要类群，已经有报道表明，这类菌群对海洋碳循环有着极其重要的作用。全面理解AAPB的广泛分布和独特功能将对目前建立在产氧光合作用基础上的海洋能量和氧平衡的理解产生深远的影响。然而一直以来，由于单细胞细菌叶绿素含量很低，且受叶绿素的红外干扰，BCM的准确定量比较困难。

目前为止，用于海洋中BCM的计数方法主要有以下几种：红外快速脉冲速率(IRFRR)诱导荧光瞬时动力学技术(Kolber et al.，2000)、红外落式荧光显微镜技术(IREM)(Kolber et al.，2001)、高效液相色谱法(HPLC)(Goericke，2002)、双重调节技术(dual modulation techniques)(Koblízek et al.，2005)和定量聚合酶链式反应(QPCR)(Schwalbach and Fuhrman，2005)等。

上述各种方法中，无论是监测细菌光合作用过程中电子传递的IRFRR技术，还是直接测定细菌叶绿素a和叶绿素a的含量及比值(BChl.a/Chl.a)的HPLC技术以及基于光合基因的定量QPCR技术都不能直接提供海洋中BCM的丰度，实现对微生物功能群的直接测量。而以BChl.a所发的红外荧光为检测信号IREM技术则是检测海洋中BCM丰度的最简便的方法(Kolber et al.，2001；Schwalbach and Fuhrman，2005)。但是，实践发现，所有含叶绿素的自养生物都会被IREM法计入BCM中，因为它们在适当波长的光的激发下都能在一定程度上发出红外荧光。而野外海水样中，蓝细菌(海洋环境中常见的属为原绿球藻和聚球藻)的丰度大到足以干扰BCM计数，导致了IREM法的显著阳性误差(Zhang and Jiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)。申请者在东海的检测分析发现，浅水域中由聚球藻所引进的正误差可高达30％(Zhang and Jiao2007)。即便是应用此类蓝细菌(聚球藻)的红色荧光图像从细胞粒径上或者通过红外、红色荧光信号的差减进行误差校正，而由另一类蓝细菌——原绿球藻所引进的误差则又无法计算。因为原绿球藻不仅粒径与细菌细胞相似，而且所发出的红色荧光信号可被海水样中共存的具强荧光的聚球藻(Synechococcus)所掩盖，从而在最初的蓝细菌红色荧光视野下无法被观察到。在经典的落式荧光显微镜(EM)或IREM法中，为了防止聚球藻荧光猝灭而进行快速观察，导致在采用最初的蓝细菌图像进行误差校正时，而无法实现原绿球藻对BCM计数造成的严重误差的校正(Zhang and Jiao 2004；Schwalbach and Fuhrman，2005)。

发明内容

本发明的目的在于针对IREM法不能解决的聚球藻和原绿球藻共存所引起的海洋中BCM计数的误差，提供一种新的能对海洋中BCM进行准确定量的海洋中含细菌叶绿素的微生物的定量方法。

本发明的技术方案是基于时间序列观察的扣除蓝细菌误差的红外落式荧光显微镜法(Time-series observation based cyanobacteria-calibrated Infrared Epifluorescence Microscopy，TIREM)，该法能准确计算出聚球藻和原绿球藻的总数，再通过逻辑运算从而对海洋中BCM进行准确计数。

本发明包括以下步骤：

1)将样品预过滤、固定、DAPI(4’6-diamidino-2-phenylindole，一种双链DNA荧光染料)染色、过滤并制片；