[发明专利]一种聚肌胞联合二甲基三十六烷基铵混合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用有效
申请号: | 201110199072.X | 申请日: | 2011-07-15 |
公开(公告)号: | CN102247595A | 公开(公告)日: | 2011-11-23 |
发明(设计)人: | 祝秉东;达泽蛟;牛红霞;辛奇;于红娟;李青;章国平;李志;刘万波;张颖 | 申请(专利权)人: | 兰州大学 |
主分类号: | A61K39/39 | 分类号: | A61K39/39;A61K39/04;A61P31/06 |
代理公司: | 北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249 | 代理人: | 陆菊华 |
地址: | 730000 甘*** | 国省代码: | 甘肃;62 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 聚肌胞 联合 甲基 三十六 烷基 混合 佐剂 制备 结核 单位 疫苗 中的 应用 | ||
技术领域
本发明涉及生物制剂领域,具体涉及一种聚肌胞联合二甲基三十六烷基铵混合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用。
背景技术
肺结核是世界范围内导致人类死亡的主要感染性疾病之一。牛型分枝杆菌Bacilli Calmette Guerin (BCG)是目前唯一的抗结核病疫苗。BCG是来源于上个世纪牛型分枝杆菌的减毒株,并历时13年的体外传代培养所得。几十年来,BCG疫苗在世界范围广泛应用,但是不同的地域其有效性有巨大的差异。BCG在成人中的保护效应也较差。因此,安全、有效的抗结核疫苗是必不可少的。在众多新疫苗中,亚单位蛋白疫苗是最有前景的疫苗。
由于亚单位疫苗自身免疫原性较弱,所以必须选择合适的佐剂以增强疫苗的免疫效果。阳离子脂质体—二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)能诱导较强的细胞免疫反应,已作为佐剂应用于蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗。目前,一种新型的复合佐剂CAF01,就是以能够引起较强的Th1免疫反应的DDA为基础研发的,并已用于各种疫苗的基础研究,如结核疫苗、疟疾疫苗等。该佐剂的另一个成份为trehalose 6,6-dibehenate(TDB),是来源于结核分枝杆菌细胞壁索状因子(the cord factor)类似合成物。聚肌胞(PolyI:C)是作用于Toll样受体(TLR3)的激动剂,可用于疫苗佐剂。PolyI:C及相关化合物已广泛应用于临床治疗病毒感染。
兰州大学已构建的融合蛋白Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4,简称AMM。该融合蛋白是将结核分枝杆菌几种分泌抗原Ag85B、MPT64190-198和Mtb8.4串连表达,其中MPT64190-198是抗原MPT64第190-198位氨基酸,为CD8+T细胞表位。前期研究表明,在有效佐剂的辅助下,融合蛋AMM能诱导较强的细胞免疫应答。
发明内容
本发明的目的就是针对上述缺陷,提供了一种将PolyI:C联合DDA混合作为融合蛋白AMM的佐剂,研究该混合佐剂在结核病亚单位疫苗中的佐剂效应,以期望得到可用于临床研究的混合佐剂。
为实现上述目的,本发明提供了一种聚肌胞联合二甲基三十六烷基铵混合佐剂在制备结核亚单位疫苗中的应用。
所述结核亚单位疫苗的制备包括以下步骤:
1)将聚肌胞用磷酸盐缓冲液溶解至0.5mg/ml,得到聚肌胞溶液;
2)将融合蛋白Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4用无菌PBS溶液稀释至0.4mg/ml,得到融合蛋白溶液;
3)将二甲基三十六烷基铵用无菌蒸馏水配制成2.5mg/ml的溶液,置于80℃下水浴10min,而后冷却至室温,得到二甲基三十六烷基铵溶液;
4)取步骤1)得到的聚肌胞溶液和步骤2)得到的融合蛋白溶液按照体积比1:1充分混匀并室温放置1min,得到蛋白/聚肌胞混合溶液;
5)在步骤4)得到的蛋白/聚肌胞混合溶液中逐滴加入步骤3)得到的二甲基三十六烷基铵溶液,蛋白/聚肌胞混合溶液和二甲基三十六烷基铵溶液的体积比为1:1,充分乳化后,得到结核亚单位疫苗
本发明的有益效果为:本发明提供的混合佐剂DDA/PolyI:C,能够有效增强融合蛋白AMM的抗原特异性IFN-γ的分泌水平,减轻H37Rv感染造成的病理损伤,是预防肺结核疫苗的有效佐剂。AMM疫苗加强免疫小鼠两次或者AMM疫苗强化BCG免疫两次后,研究混合佐剂疫苗组佐剂效应。应用ELISPOT检测免疫小鼠抗原特异性IFN-γ水平,AMM疫苗强化BCG免疫两次后,经小鼠尾静脉H37Rv攻击后,通过肺部荷菌量和肺部病理损伤面积综合评价混合佐剂在结核亚单位疫苗中的佐剂效应。结果表明:混合佐剂组(AMM+DDA/PolyI:C)和单独佐剂组(AMM/DDA)加强免疫两次后,脾脏淋巴细胞经抗原AMM刺激后,皆可产生分泌较仅有融合蛋白AMM组高的IFN-γ; 肺部荷菌量试验表明佐剂实验组加强BCG免疫后,肺部荷菌量都较PBS组低;肺组织病理分析显示混合佐剂组AMM+DDA/PolyI:C强化BCG免疫后,肺组织病理损伤较BCG组和DDA为佐剂加强组轻(P<0.05)。结论:PolyI:C联合DDA混合佐剂可有效减轻结核分枝杆菌H37Rv感染导致的肺部病理损伤。
附图说明
图1为免疫小鼠脾淋巴细胞产生的抗原特异性IFN-γ对照图。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于兰州大学,未经兰州大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201110199072.X/2.html,转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇:吸尘器
- 下一篇:一种释放负离子的立体印花窗帘及其印花浆料的制备技术