[发明专利]菘蓝根外植体器官发生方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用植物组织培养技术培养菘蓝试管苗无菌根获得再生植株的方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

菘蓝( Isatis indigotica Fort. )为十字花科（ cruciferae ）菘蓝属（Isatis Linn） 2年生草本植物。菘蓝全株入药，是我国南北各地广为栽培的药用植物。在中药学中，菘蓝的干燥根称为板蓝根，干燥叶称为大青叶，两者都具有清热解毒、凉血消斑的功效，广泛用于各种方剂中。大青叶中所含生物碱类化学成分靛玉红还有治疗慢性粒细胞白细胞病的作用。

利用组织培养进行快速繁殖和高产栽培、对节约耕地、提高产量有重要意义。在植物离体器官发生过程中，根据不同的培养条件，不定芽可以不经过愈伤组织阶段从外植体上直接分化形成（直接器官发生）；也可以从外植体脱分化形成的愈伤组织中发生（间接器官发生）。有关菘蓝组织培养直接器官发生和间接器官发生生成不定芽均有报道。叶片在MS + 6 - BA 2 mg/L+ NAA 1 mg/L培养可直接诱导形成不定芽（中草药，1995，（1）：52）；用含KT 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L的MS培养基诱导菘蓝下胚轴分化形成不定芽，诱导率达87.5%（西南师范大学学报，2004，29（6）：1069）；用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎为外植体（四川师范学院学报，1991，12（4）:358），以下胚轴为外植体分别建立了菘蓝的快速繁殖体系（中国中药杂志，1993，18（1）:21），这些都是直接器官发生的报道。而附加 6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.2 mg/L 的MS培养基诱导欧洲菘蓝子叶愈伤组织（湖北大学学报（自然科学版），2006，28（2）:183），以及“不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应，广西热带农业，2007，（6）:30”等报道是菘蓝通过间接器官发生途径再生。

组织培养过程中，采用不同来源外植体和不同培养条件对优化培养过程，降低生产成本具有积极意义。根段相对于其他类型外植体具有以下优点：首先，它们很容易获得，其次，根作为外植体不会彻底杀死供体植株，另外，根中还可获得稳定的次生代谢产物。液体培养作为试管苗培养的方式也有着独特的优点，液体培养基省略了琼脂等凝固剂，降低了经济成本，减少了凝固剂的杂质，保证了培养基在分批配制中的一致性，并且液体培养基更易于配制。

已有的菘蓝组培文献报道中，无论是直接器官发生、还是间接器官发生，都是以菘蓝子叶、叶片、下胚轴或子房为外植体，在固体培养基上通过不同激素的配比，诱导外植体的分化，完成其再生过程。

发明内容

本发明的目的是以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根，毛状根进一步培养可逐步分化出不定芽，进而生根、长成完整植株。本发明具有取材方便，不受季节限制，诱导增殖系数高，培养时间短的优点。

本发明的实现过程如下：

一种菘蓝根外植体器官发生方法，包括毛状根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于：以菘蓝试管苗或无菌苗的根为外植体，培养形成大量的毛状根。

毛状根的培养：选取在MS固体培养基上继代培养的菘蓝试管苗根或10-15天的无菌种子苗幼根，切成长度为0.5～1.0cm的根段，作为培养外植体；外植体接种于液体分化培养基上进行培养，诱导形成毛状根。

所述的MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，pH为5.8～6.2；

液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加0～2 mg/L 6-BA，0～1mg/ L NAA， 30 g/L蔗糖，调pH到5.8～6.2。

上述形成的毛状根在固体或液体分化培养基上分化形成不定芽，液体分化培养基组成为：MS基本培养基，附加0～2 mg/L 6-BA，0～1mg/ L NAA， 30 g/L蔗糖，调pH到5.8～6.2；固体分化培养基是在液体分化培养基中加入7 g/L琼脂。

上述形成的不定芽切成单株，接种至生根培养基中生根，生根培养基组成为：MS基本培养基，附加0～1 mg/L IBA，0.5～1mg/L NAA，30 g/L蔗糖，7 g/L琼脂，调pH到5.8～6.2。

继代苗或无菌苗的培养、毛状根培养、分化不定芽、生根培养温度为25 ± 2 ℃，光照强度是30～40 mol·m^-2·s^-1，16 h / 8 h光/暗培养，液体振荡培养转速80 r/min。

本发明的优点和积极效果：