[发明专利]一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程生物技术领域，涉及一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的制备及其药学应用。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员。与肿瘤坏死因子超家族其它成员类似，可溶性形式的肿瘤坏死因子相关配体以三聚体形式与靶细胞表面三聚体化的受体分子结合而发挥生物学功能。肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋亡的作用是通过与肿瘤细胞上的死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)的相互作用传递死亡信号而实现的。虽然肿瘤坏死因子超家族的其它成员由于具有全身性的毒副作用而使应用受到限制，但是肿瘤坏死因子相关凋亡配体是一个相对安全、具有肿瘤选择性的抗肿瘤物质。肿瘤坏死因子相关凋亡配体在体外能诱导多种肿瘤细胞和癌化细胞的凋亡，并且在小鼠的移植异种肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等多种模型中具有较好的抗肿瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人类灵长类动物中全身给药时，TRAIL表现出较小或没有毒性。基于以上原因，重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体已经在进行肿瘤治疗的临床研究。

但是近来一些报道显示：除了诱导肿瘤细胞的凋亡外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体还涉及到天然免疫和获得性免疫，和自身免疫性疾病相关。例如，近来的研究报道表明它在胸腺的发育过程中调节负向选择或凋亡胸腺细胞，并且在诱发自体免疫性疾病如I型糖尿病中起重要作用。此外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体的受体在整个身体广泛性表达，肿瘤坏死因子相关凋亡配体还参与肝细胞死亡和肝炎。因此在临床上重复、全身性使用大剂量外源性肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白可能会导致不可预料的免疫结果。这些报道使科学家非常担心肿瘤坏死因子相关凋亡配体在临床中重复和持久使用时产生潜在的副作用。如何在肿瘤治疗时，避免肿瘤坏死因子相关凋亡配体对其它组织的毒副作用，这是肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)在潜在的临床应用中面临的难题。

发明内容

为克服野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗方面所面临的缺陷，本发明目的在于：发明一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，将其靶向输送到肿瘤组织中，以此提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的疗效，降低其毒副作用，从而能在治疗肿瘤疾病中得到应用。

氨基酞酶N(Aminopeptidase N，APN)/CD13蛋白是一种经研究证明只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上的蛋白质(Pasqualini R，Koivunen E，Kain R等，Cancer Res.2000，60：722-727)，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达CD13，近年来发现氨基酞酶N/CD13也与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi N，Ishii H，Mimori K等，J Clin Invest.2010，120：3326-3339；Fontijn D，DuyndamMC，van Berkel MP等，Br J Cancer.2006，94：1627-1636；Fujii H，NakajimaM，Saiki I等，Clin Exp Metastasis.1995，13：337-344)。

为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送，提高其抗肿瘤疗效、降低其毒副作用的目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，是具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质，它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质，即利用常规基因工程方法通过人工合成或者克隆构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因、可溶性地重组表达和简便地分离纯化。所述CD13的配体可以是一种含有NGR序列的多肽，优选为一种带有环状结构的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。

上述的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所构成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体之间可以添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽为1-25个氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。

上述的CD13的配体放置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体N端时，在CD13的配体之前增加一个不含支链的氨基酸，主要是丙氨酸或甘氨酸，以防表达时出现的N端氨基酸降解，影响CD13配体的功能。