[发明专利]用于冻存单个核细胞的冻存液

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于冻存单个核细胞的冻存液及其制备方法。

背景技术

正常情况下，液体冻结时会产生规则或不规则的晶体，易造成细胞膜破裂进而对活细胞造成直接损伤。因此，为减少冻存过程中细胞的损伤，往往需要使用含低温保护剂的冻存液。常用的低温保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油和葡聚糖等，其中以DMSO最为常用。使用纯动物血清结合DMSO是常用的冻存液，但动物血清可能含有动物性的病原微生物，有可能与冻存的细胞发生交叉感染，一旦发生感染，后续复苏和洗涤很难清除。培养基和羟乙基淀粉溶液也常作为细胞冻存液的主要成分，用于细胞冻存。

单个核细胞（MNC）是由新鲜脐带血或骨髓经过密度梯度离心后获得的包括淋巴细胞、单核细胞等在内的细胞混合群体，其中含有一些干细胞和祖细胞。

MNC成分复杂，各种类型的细胞在冻存过程的耐受能力有差异，各种类型的细胞适用的冻存液往往不同。因此，现有的冻存液用于MNC的冻存效果往往不够理想。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于冻存单个核细胞的冻存液，可适用于单个核细胞中各种类型细胞的冻存，提高了单个核细胞的冻存效果。

一个方面，本发明提供一种用于冻存单个核细胞的冻存液，包含血浆和二甲基亚砜。本发明提供的用于冻存单个核细胞的冻存液，包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于血浆和二甲基亚砜，也可以包含动物血清和培养基等成分。

脐带血血浆中富含各种矿物质离子和蛋白因子，提供细胞代谢所需物质并维持细胞所需的渗透压，是天然的营养体系和缓冲体系。将自体脐带血血浆用于脐带血来源MNC的冻存，避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，可使MNC的冻存更加安全有效，便于冻存细胞后续的临床应用。

作为本发明的进一步改进，所述血浆的体积百分比为90%~95%；所述二甲基亚砜的体积百分比为5%~10%。

二甲基亚砜（DMSO）是最常用的低温保护剂，但DMSO具有较强的毒副作用。因此，在保证冻存效果的同时，尽量减少DMSO的使用量，可减少细胞的损伤，使MNC的冻存更加安全。

另一方面，本发明提供一种制备用于冻存单个核细胞的冻存液的方法，包括以下步骤：

A）取新鲜脐带血于无菌离心管中，在2800 rpm离心16 min后，收集上清液，即为血浆；

B）将所述血浆和所述二甲基亚砜混合均匀，血浆的体积百分比为90%~95%，二甲基亚砜的体积百分比为5%~10% 。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：将脐带血MNC分离中富余的血浆用于MNC的冻存，实现了富余血浆的“废物利用”，不用专门购买动物血清、培养基等昂贵试剂，节约了资源和成本；可适用于MNC中各种类型细胞的冻存，提高了MNC冻存的细胞复苏活率，冻存效果好；避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，可使MNC的冻存更加安全有效，便于冻存细胞后续的临床应用。

附图说明

图 1 为本发明实施例四中造血干细胞CD34表达流式检测结果；图1-a：冻存前；图1-b：DMEM冻存后；图1-c：HES冻存后；图1-d：血浆冻存后。

图 2 为本发明实施例五中细胞集落形态特征图；图1-a：红细胞集落，放大倍数为100倍；图1-b：爆式红细胞集落，放大倍数为100倍；图1-c：巨噬细胞集落，放大倍数为100倍；图1-d：粒-巨噬细胞集落，放大倍数为100倍；图1-e：混合大集落，放大倍数为100倍；图1-f：粒细胞集落，放大倍数为40倍。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一  冻存液的配制。

超净工作台中，取新鲜脐带血于无菌离心管中，在2800 rpm离心16 min后，收集上清液，即为血浆。将血浆（Blood plasma）和二甲基亚砜（DMSO）按19:1的体积比混合均匀，得本发明提供的血浆冻存液。

为便于冻存效果的比较，配制现有技术的DMEM冻存液：DMEM基础培养基与DMSO以19:1的体积比混合均匀；HES冻存液：医用6%羟乙基淀粉溶液（HES）与DMSO以19:1的体积比混合均匀。本文中，DMEM指的是DMEM基础培养基，HES指的是医用6%羟乙基淀粉溶液。

实施例二  MNC的冻存。