[发明专利]一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学研究领域。发明涉及一种高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制备和应用。

背景技术

端粒酶(Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的核糖核蛋白，它包含两种基本成分：逆转录酶催化亚基hTERT和RNA组分hTR。端粒酶能以自身RNA为模板，反转录合成端粒重复列，加到染色体的末端，以弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失，维持端粒的长度。研究表明在正常人体细胞内端粒酶活性几乎检测不到，因此，人正常体细胞分裂次数是有限的，细胞每分裂一次，端粒便丢失50-200bp，当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制，即称为细胞衰老，并走向死亡。然而，在绝大多数恶性肿瘤细胞(85％)中普遍可以检测到端粒酶活性且活性较强，端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖过程中的持续丢失，从而使得细胞可以不断的分裂，这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。

Kim等分析总结了大量研究结果，检测了100多种恶性肿瘤标本，指出端粒酶诊断肿瘤的敏感性为85％，特异性为91％，阳性预测值为91％，阴性预测值为81％，充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值(Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science.1994 Dec 23；266(5193)：2011-5.)。端粒酶的激活被认为是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。有许多公司正在开发端粒酶抑制剂治疗肿瘤，其中GRN163L已经开始了临床2期实验，几个端粒酶疫苗也即将完成临床试验进入市场。

LPTS(Liver Putative Tumor Suppressor)是本发明人利用定位克隆的方法从人的正常肝cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基因[C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 2000，32721-727]。LPTS基因定位于人第8号染色体8p23区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或检测不到，将LPTS基因导入肝癌细胞，能抑制肝癌细胞的生长、增殖、最后引起死亡[Liao C，Zhao MJ；Mutation analysis of novel human liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2003，9：89-93]]。LPTS基因于2004年已获得中国发明专利授权(赵慕钧等：“一种肝癌相关基因及其应用”，专利号：ZL 00115395.1，专利权人：中国科学院上海生物化学研究所；授权公告日：2004年10月13日)。2001年Lu博士的实验室报导了LPTS基因的另一个全长转录本PinX1，发现PinX1编码的蛋白可以结合端粒酶催化亚基hTERT并抑制端粒酶活性[Zhou X.Z.，Lu K.P；The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359]，从机制上第一次证明了LPTS/PinX1作为一种天然的端粒酶抑制蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖，为肿瘤的靶向治疗提供了新的途径。本发明人在2005年申请了一项有关制备LPTS蛋白的发明专利(赵慕钧等：“端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化”，专利申请号：200510030526.5，申请日：2005年10月14日；专利权人：中国科学院上海生命科学研究院)。在该专利中提供了LPTS蛋白(LPGENE1)和LPTS抑制端粒酶的活性片段LPTS133-328(LPGENE2)的制备方法，并提供了LPTS抑制端粒酶的活性片段位于其C端的133-328氨基酸残基。本发明人在2008年申请的专利揭示了TAT与LPTS133-328的融合蛋白(专利申请号：200810041324.4)，经证实该融合蛋白可穿透细胞膜的且具有极其优异的抑制肿瘤细胞生长的效果。