[发明专利]HLA-B*1502基因的SYBR Green I检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中目的基因的分子生物学检测方法，特别是涉及HLA-B*1502基因的SYBR Green I检测方法及其专用引物与试剂盒。 

背景技术

药物不良反应(ADR)指正常剂量的药物用于预防、诊断、治疗疾病或调节生理机能时出现的有害的和与用药目的无关的反应。部分ADR较轻微，但有些ADR可导致延长住院期、终生残疾甚至死亡。抗癫痫药物是引起皮肤型不良反应的常见因素。皮肤型不良反应包括轻度的斑丘疹及危及生命的严重不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens Johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(toxicepidermal necrolysis，TEN)等。卡马西平是一种临床上广泛使用的治疗癫痫、躁狂抑郁症及神经病理性疼痛(如牙疼、偏头痛、带状疱疹等)的药物，也是临床上常见的引起严重皮肤不良反应的因素。2007年12月12日，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了关于卡马西平的安全性信息，信息称，服用卡马西平(carbamazepine)可引起严重的皮肤不良反应(即SJS和TEN，这两种病症是严重的皮肤和粘膜反应，可导致永久性残疾甚至致命)而这种过敏反应在含人白细胞抗原等位基因HLA-B*1502的患者中更容易发生。根据国内外研究结果及统计分析显示，HLA-B*1502等位基因与卡马西平敏感引起的严重皮肤不良反应具有很强的关联性。服用卡马西平者，如具有HLA-B*1502基因，其产生史蒂芬强森症候群毒性表皮溶解(SJS/TEN)的风险是无HLA-B*1502基因患者的800倍以上。HLA-B*1502基因几乎仅见于亚裔血统中(包括南亚的印度人)。在中国、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾和台湾部分地区人群中，有10-15％携带HLA-B*1502基因，而欧洲人群中，概率仅为1％-2％。因此，在服用卡马西平等抗癫痫药物的亚裔人群中，开展HLA-B*1502基因的检测，对预防可能发生的严重皮肤过敏反应具有十分重要的临床意义。 

人白细胞抗原等位基因HLA-B*1502位于人类第六条染色体上，属于人类白细胞抗原HLA中的一型。目前，检测HLA-B*1502基因的方法主要有流式细胞仪检测法和SSP法。流式细胞仪检测法主要检测的是细胞表面抗原的表达，通过抗原表达 的百分比，来确定是否具有该基因的表型。这种方法的缺陷在于结果的稳定性上。因为在进行流式细胞仪检测前，需对检测样本进行预处理。预处理的方法及预处理的时间上的不同，有时候会影响细胞表面抗原的表达，从而影响最终的结果判断，导致检测结果上的差异，容易造成漏检或其它情况。SSP法检测的是基因型，而不是看该基因的表达，所以从结果上来说，确定性和唯一性会比流式细胞检测的方法要好，即只要存在该基因，通过设计好的特异性引物，即可结合引物的扩增情况，判读最终结果。SSP方法的缺点主要在于结果检测起来不够简便，扩增后的产物需要进行电泳，费时费力，而且在需要检验人员在目的条带的判读上具有一定的经验。SSP方法的另一个缺点在于通常需要几管引物才能区分出HLA-B*1502的基因，引物的设计上也要多方面的考量，保证扩增片段的特异性。申请号为200810026919.2的专利公开了一种检测HLA-B*1502的方法，该方法需要6管引物才能做一人份检测，该方法也可算作是通过SSP的方法检测基因型，但在引物设计上还有可改良的地方。总体而言，流式细胞仪的方法操作起来较为简便，但由于该方法是检测抗原的表达，所以结果有可能因为实验操作或其它因素导致偏差；而SSP法检测的是基因型，结果唯一准确，但通常需要多管引物，并且需要电泳来检测结果，操作而且起来较烦琐，不太适用于临床检验。此外，由于B*1502基因只有少数几个碱基位点存在特异性(与其它序列高度相似的罕见型基因如B*1505、B*1588、B*1531和B*1555的区别碱基)，在设计特异性引物后再无其它特异位点用以另行设计探针，因而也就不能应用TaqMan探针的荧光法进行B*1502基因的检测。 

因次，市场上迫切需要一种特异性高、灵敏度高、省时省力的检测HLA-B*1502基因的方法及其试剂盒。