[发明专利]一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。

背景技术

微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程中的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上， 自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个崭新的研究领域。

自从瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer ^[1]首次提出微型全分析系统（μ-TAS）以来，微流控芯片就以其高效、快速、试剂用量少、低耗以及集成度高等优点引起了国内有关专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景^[2~^4]。

蛋白质的酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关数据库后完成对蛋白的鉴定。由于传统的溶液酶解灵敏度低而且耗时（12小时以上），加上溶液酶解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，溶液酶解时蛋白和酶的比例要求在20~40：1。所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测小体积样品的酶法和免疫法分析和检测。其中一个很重要的用途是用于蛋白质的酶解和分析。

解决上述问题的途径之一就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋^[5,6]技术固定在芯片微流通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。脲醛树脂系尿素与甲醛反应制得的的常用聚合物，价格低廉。通常采用尿素与甲醛在碱性条件下加热生成脲醛树脂预聚物水溶液，然后在酸性条件下进一步缩聚成脲醛树脂。由于脲醛树脂预聚物含有大量的羟甲基，可以与酶中的谷氨酰胺和天门冬酰胺残基交联生成共价键，从而实现酶的共价键固定^[7]。

本发明将蛋白水解酶通过脲醛树脂预聚物表面的羟甲基固定在插入微流控芯片中的玻璃纤维芯表面或者微流控芯片通道内表面，制得蛋白酶解微流控芯片，由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，可以使用较大的酶量，该反应器可将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到10秒，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片具有制作简便、价格低廉和稳定性高的优点，可采用浸涂和注射涂布的技术批量加工。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新的微流控芯片酶反应器，如血糖测定用微流控芯片酶反应器等。

参考文献

[1]   Manz A, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators B 1990, 1, 244~248.

[2]   Dittrich, PS, Tachikawa K, Manz A. Anal. Chem. 2006, 78, 3887~3908. 

[3]   Auroux PA, Iossifidis D, Reyes DR, and Manz A. Anal. Chem. 2002, 74, 2637~2652.

[4]   Verpoorte E. Electrophoesis 2002, 23, 677~712.

[5]   Qu HY, Wang H., Huang Y, et al. Anal. Chem. 2004, 76, 6426–6433.

[6]   Wu HL, Tian YP, Liu BH, et al. J. Proteome Res. 2004, 3, 1201–1209.

[7]   Vinod VP, Shinde S, D'Britto V, et al. Biotechnol. Prog. 2006, 22, 1585–1590.。

发明内容

本发明的目的在于提出一种制作简便、价格低廉和稳定性高的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。