[发明专利]人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包括以细胞爬片技术提取人脐带间充质干细胞进行分离培养，并加入表皮生长因子、地塞米松、肝细胞生长因子、抑瘤素将所述细胞分阶段定向诱导分化为肝细胞。

2.权利要求1所述的诱导方法，其中所述分离培养的具体步骤为：

(1)将8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na₂HPO4、0.2g的KH₂PO4用水定容为1L，制成磷酸缓冲液，以缓冲液反复冲洗脐带，去除残留的血液，获得干净脐带；

(2)将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；

(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm的小脐带组织块；

(4)再将获得的小脐组织带块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；

(5)直径为1-1.5mm脐带块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带块接种于细胞培养皿中；

(6)不加培养液，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置三小时；

(7)然后加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合；

(8)胰酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；

(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；

(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

3.权利要求1或2所述的诱导方法，其中所述分阶段定向诱导的具体步骤为：

(1)使用含2％的Fetal bovin serum(FBS)、10^-8mol/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF(肝细胞生长因子)、10ng/ml的EGF(表皮生长因子)1％ITS(25g/L胰岛素、25g/L转铁蛋白、25mg/L亚硒酸钠)的DMEM-F12培养基诱导培养2周；

(2)使用含2％的FBS、20ng/ml的OSM(抑瘤素)、10^-6mol/L的DXM、1％ITS的DMEM-F12培养基诱导培养2周。