[发明专利]一种微小RNA及其前体和反义核酸在调节过氧化氢酶活性中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及用于调节过氧化氢酶活性的微小 RNA(miRNA)、其前体和其反义寡核苷酸序列，以及它们在预防和治疗 心血管疾病等一系列老年性疾病和减轻炎症反应中的用途。

背景技术

微小RNA(microRNA，miRNA)，是一种长度为22nt左右的单链非 编码RNA，它们通过影响信使RNA的稳定性来调节基因的表达。miRNA 最早在线虫中发现，1993年Lee等发现lin-4通过互补的RNA-RNA相互 作用来调节lin-14的翻译，最终影响线虫的发育。

到目前为止，在各个物种中都发现了miRNA，而其功能也不断为人 们所揭示。这些miRNA广泛存在于各种生物体中，参与细胞的增殖、凋 亡、分化、代谢以及个体发育过程。不少研究工作证明，miRNA在线虫、 果蝇和哺乳动物等物种之间存在高度的保守性，加之线虫的整个发育过程 中各个细胞的来源以及命运都已经被清楚的阐释，因而在研究miRNA的 工作中，线虫作为一种成熟的模式生物被广泛应用。

目前对大部分miRNA的生物功能还知之甚少，对各种miRNA表达以 及功能的进一步研究是十分必要的。线虫作为一种模式生物，其生物学背 景清楚而且各种突变体种类齐全。与其他哺乳动物相比，秀丽线虫生命周 期短，只有3周左右，最常用的是秀丽隐杆线虫(Caenorhabdiris elegans)， 其成虫长约1mm，全身透明，在25℃下寿命约为2周，20℃下寿命约为3 周，主要以雌雄同体形式存在。因此，在抗氧化酶和衰老的研究中，线虫 有很大优势。

当今普遍认为，细胞正常代谢过程中不断产生的自由基，随着年龄的 增加，细胞内氧自由基不断积累，而自由基可以引起DNA损伤，还可使 细胞中的多种物质发生氧化，损害生物膜，此外还能够使蛋白质、核酸等 大分子交联，影响其正常功能，最终使相应的组织和器官的功能丧失，产 生一系列衰老的症状。自由基的衰老学说为神经退行性疾病、心血管疾病 等老年性疾病以及炎症反应的发生发展提供了理论依据。在许多炎症反应 以及心血管疾病等老年性疾病的发生发展过程中，氧自由基均起了促进疾 病进一步发展恶化的作用。2000年的science报道，给线虫饲喂 SOD/catalase类似物可以延长线虫的寿命。因此，研究开发能够降低细胞 内氧自由基水平的药物具有极大的应用前景。

超氧化物歧化酶(SOD)是广泛存在于各种生物体中的超氧自由基清 除因子，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢，然后由过氧化氢酶 (catalase)将过氧化氢分解为水和氧气。线虫的过氧化氢酶有三种，在染 色体上按如下顺序排列：ctl-3，ctl-1，ctl-2，三者的上下游都存在DAF-16 的结合基序，是DAF-16的下游靶基因，同时三者在序列上也极其相似。 ctl-1和ctl-3具有相同的3’UTR，ctl-1主要在胞质中起作用。ctl-2则主要 在过氧化物酶体中起作用，ctl-3主要在线虫咽部的肌细胞和神经细胞中表 达。有研究报道，单独缺失ctl-1不会影响线虫的寿命以及其产卵的能力； 单独ctl-2的突变使原本长寿的clk-1线虫的最大寿命缩短，但平均寿命不 变，同时使该线虫的产卵期提前。此外，该种ctl-2缺失突变体的生长发育 受到显著影响，并且出现早老现象，产卵能力下降，过氧化物酶体的形态 异常等现象。在线虫中SOD有五种异构体，sod-1和sod-2在繁殖阶段分 别编码细胞质的铜锌SOD和锰SOD，其中sod-1对总的SOD活性起主要 的调节作用。sod-5和sod-3分别编码铜锌SOD和锰SOD，但这两种基因 所编码的异构体比较少而且只起辅助补充作用，在dauer幼虫阶段表达才 显著升高。编码细胞外铜锌SOD的sod-4基因可以延长缺失daf-2线虫的 寿命。同时有实验证明过氧化氢水平升高会加强过表达sod-1的线虫的氧 化应激反应。

发明内容

在本发明中使用的缩写和术语含义如下所示：

RT-PCR：Real time polymerase chain reaction，实时定量荧光聚合酶链 式反应；

miRNA：microRNA，微小RNA

Trizol：总RNA抽提试剂

DEPC：diethylprocarbonate，二乙基焦碳酸酯。