[发明专利]一种多肽修饰的脑靶向纳米器件及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向纳米器件，具体涉及一种由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米器件及制备方法和用途，尤其涉及一种由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米器件及制备方法和其在脑内激活型Caspase-3成像中的应用。

背景技术

神经退行性疾病包括阿尔茨海默病和帕金森病是具有较高发病率和死亡率的一类疾病，具有病程长，进展性，缺乏明确的诊断测试等特点，且在出现明显症状如运动障碍等之前，已经伴随有一些列的病理特征包括不可逆的神经元死亡等发生；因此，早期的检测和诊断对于治疗这类疾病至关重要，尤其是延缓和阻止神经元的死亡。神经退行性疾病发生时脑部的改变通常在化学水平，不易于被磁共振成像(MRI)以及断层扫描(CT)发现；在神经退行性疾病早期对其进行诊断充满挑战。此外，血脑屏障的存在虽然在一方面维持了中枢神经系统的稳态，但同时它也阻碍了治疗和诊断药物通过全身给药方式递释入脑内，尤其是对于大分子药物。

现有技术公开了有关神经元死亡是神经退行性疾病的典型特征；因此，发现异常和凋亡的神经细胞并给予及时的治疗显得尤为重要。有研究发现，由Caspase介导的凋亡途径在慢性神经退行性疾病中介导细胞死亡发挥着重要的作用；而Caspase-3的激活在神经细胞的凋亡中普遍存在。虽然，引起这类疾病的确切机制还尚未明确，但Caspase-3激活途径的参与已获得广泛共识。所述的Caspase-3通常在细胞内以非活性32k道尔顿分子量的酶原形式存在；在凋亡发生时，上游的蛋白酶信号可将其裂解为12k和17k道尔顿的亚单位。有报道证明了激活型Caspase-3阳性的黑质多巴胺能神经元比例在帕金森病中明显升高；因此，实现激活型Caspase-3的体内检测，将会有益于监测潜在的神经元损伤，并及时给予干预。

为了达到上述目的，诊断试剂必须具备跨过血脑屏障的能力。所述的血脑屏障主要是由脑毛细血管内皮细胞组成的紧密连接，使得绝大多数分子难以从血液进入脑内。目前，由受体介导的内吞途径因其具有较高的选择性和透过效率，而更多的被应用于药物递释系统的跨血脑屏障转运策略中；同时，由狂犬病毒糖蛋白衍生的29个氨基酸多肽(RVG29)，在前期的研究中，已经被证明是一种高效的脑靶向头基介导药物的跨血脑屏障递释。

研究证实，聚左旋赖氨酸树枝状分子(DGLs)是一类新型的纳米级尺寸、具有可降解性的聚合物，其单体是左旋赖氨酸，由可降解的酰胺键连接，末端具有丰富的氨基，可被进一步修饰。利用DGLs的特点结合近年来研究较为广泛的荧光共振能量转移(FRET)技术可构建脑靶向性的纳米器件，实现脑内激活型Caspase-3的成像。将荧光探针Cy5标记的含有激活型Caspase-3识别的底物序列(DEVD)的多肽通过双功能连接剂可共价连接于DGLs的表面，同时采用Cy5的淬灭剂QSY21，以非线性的方式连接于DGLs表面，通过控制合成的比例，可达到高效的分子间淬灭，进而降低背景荧光信号的干扰。

采用RVG29脑靶向头基的修饰，可通过受体介导的跨血脑屏障转运，使得纳米器件可进入脑内发挥作用；但目前尚未见有关RVG29修饰的脑靶向纳米器件报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽修饰的脑靶向纳米器件，尤其涉及一种由狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修饰的脑靶向纳米器件及制备方法。

本发明的另一目的是提供所述的脑靶向纳米器件在脑内激活型Caspase-3成像中的应用。

本发明的脑靶向纳米器件结合主动靶向和荧光共振能量转移技术，进行脑内激活型Caspase-3的成像，能为神经退行性疾病的早期诊断提供重要依据。

具体而言，本发明的多肽修饰的脑靶向纳米器件，其特征在于，由阳离子树枝状大分子材料、激活型Caspase-3特异性反应元件、淬灭剂和具有脑靶向作用的狂犬病毒糖蛋白衍生的29氨基酸多肽RVG299组成；所述的狂犬病毒糖蛋白衍生的29氨基酸多肽RVG29作为脑靶向头基，阳离子树状大分子为载体材料，通过双功能连接剂连接RVG29构建脑靶向载体。

本发明中，所述的阳离子树枝状大分子材料选自聚左旋赖氨酸树枝状分子(DGLs)和聚酰胺-胺(polyamidoamine，简称PAMAM)；

本发明中，所述的双功能连接剂为Sulfo-LC-SMPT；

本发明中，所述的激活型Caspase-3特异性反应元件选自Cy5标记的含有DEVD序列的多肽，其序列为CGDEVDAPK(Cy5)；

所述的Cy5荧光的淬灭剂为QSY21。