[发明专利]重组人Vasostatin蛋白的中试规模制备

说明书

技术领域：

本发明涉及重组人蛋白的中试规模制备方法。 

背景技术：

重组人vasostatin蛋白(Vasostatin，VAS)，最早由Pike等人于1998年从在EB病毒的悬浮液中纯化出，这种纯化的重组N末端的钙网蛋白(1-180个氨基酸)专一性地抑制了内皮细胞的增殖，且能抑制体内血管的生成。VAS是一种内源性蛋白，由180个氨基酸组成，前17个氨基酸为信号肽，含有8个反相平行的β链，可以结合Zn²⁺，能够与一些蛋白相互作用。Pike等人还对vasostatin活性区进行了研究，结果发现，主要的活性区在N端第120-180个氨基酸，此段蛋白序列具有同样的抗血管生成活性。 

研究结果提示，VAS抑制血管生成的主要原因可能具有以下几点：(1)与层粘连蛋白的α链和γ链相结合，进而抑制了内皮细胞结合到层粘连蛋白上；(2)诱导细胞凋亡；(3)促使细胞产生自由基和释放NO。最近有研究表明，VAS具有抑制炎症的作用，这是因为炎症会导致血管通透性增加，血浆外渗，白细胞增多，形成新生血管。 

本课题组利用重组腺相关病毒作为VAS表达载体(rAAV-VAS)，体外转染小鼠胰内皮细胞MS1和结肠癌细胞HCT-116，然后测定对细胞生长的影响，并通过小鼠皮下移植瘤模型，验证vasostatin的表达对肿瘤生长、新生血管密度以及对细胞增殖的作用。结果显示，使用rAAV-VAS病毒载体进行治疗后，HCT-116移植瘤新生血管的形成受到抑制，在小鼠体内的生长速度明显减缓。 

然而，重组蛋白治疗药物当前的现状是，使用rAAV病毒进行临床治疗目前还存在诸多疑虑；融合蛋白必须将两种蛋白同时使用，不利于单独使用及个性化治疗；藻酸盐包裹目的基因后形成的微囊化物质，也存在基因导入后呈长期表达，不易于表达调控的问题。(引用文献) 

本课题组已成功克隆了人VAS基因，并采用pET22b载体和E.coli BL21表达系统，中试规模制备VAS，得到了含量占菌体总蛋白50％以上的重组vasostatin蛋白。与已报道的其他包涵体蛋白的复性方法不同的是，本项研究利用层析柱上脱盐复性，简单方便地纯化了重组VAS蛋白。进一步通过细胞实验表明，所述重组VAS蛋白可用于抑制内皮细胞的增长，抑制细胞迁移，具有抗血管生成的活性。 

为了得到可溶性的VAS蛋白，本课题组还进行了真核表达研究，根据毕赤酵母偏好密码子人工合成了VAS的N端120-180个氨基酸(VASS)的DNA序列，利用pPIC9载体和毕赤酵母表达系统以及NBS 7.5L发酵罐进行中试表达制备。 

本发明的目的是提供一种重组人VAS蛋白和VASS蛋白中试规模制备的方法。 

发明内容：

本发明提供了一种基因工程中试规模制备重组人VAS蛋白的方法，所述方法是将编码基因通过原核表达载体导入大肠杆菌中表达，获得重组人VAS蛋白。其中，大肠杆菌为E.coliBL21；当编码基因导入大肠杆菌细胞系时，原核表达载体为pET22b。 

本发明所述中试规模制备重组人VAS蛋白的主要步骤是： 

1)获取Vasostatin基因：利用RT-PCR，从人的正常肝细胞中克隆Vasostatin基因(参照《分子克隆实验指南》北京：科学出版社，2002.8)； 

2)构建重组Vasostatin/E.coli BL21工程菌：采用基因工程技术构建Vasostatin重组载体pET22b-Vasostatin/E.coli BL21工程菌(参照《细胞工程与分子生物学技术》化学工业出版社2008年4月)； 

3)中试规模制备重组Vasostatin蛋白：在构建重组Vasostatin/E.coli.BL21工程菌基础上，进行7.5L发酵罐发酵，然后利用细胞反复冻融，用尿素溶解包涵体后，依次经G-25复性、DEAE结合、G-25脱盐，获得一定浓度和纯度的蛋白； 

4)Vasostatin蛋白体外抗肿瘤实验：利用重组纯化后的Vasostatin蛋白处理肝癌细胞、肺癌细胞及Hela细胞； 

5)Vasostatin体外抑制内皮细胞增殖实验：利用MTT实验检测； 

6)Vasostatin体外抑制内皮细胞迁移实验：利用transwell研究Vasostatin对体外内皮细胞迁移的作用； 

7)数据统计分析：实验数据采用平均数±标准误差。student’s t-test被应用于检验是否显著差别，P值＜0.05则视为统计学上显著差别。