[发明专利]一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化领域，尤其是一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法。

背景技术

随着人口增长的速度越来越快，甾体避孕药的出现为有效控制人口的过度增长带来了希望，孕二烯酮是新一代避孕药的主要成分之一，它以原型与孕激素受体结合，具有高度的亲和力且几乎没有雄激素和雌激素活性，口服吸收快速而完全，是目前最为理想的口服避孕药之一，本发明中催化制备的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮是“孕二烯酮”合成的关键中间体。

一般甾体类物质具有很强的疏水性(溶解度范围在10^-5～10^-4mol/L)，而甾体转化酶属于胞内酶，底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，这就导致底物与转化酶不能很好接触，造成转化率偏低，发酵时间延长。因此，提高底物的溶解性能(即有效反应浓度)，加速底物和产物分子的传递，是提高甾体转化反应效率的关键技术之一。有报道说，可将有机溶剂应用于甾体转化作为促溶剂，以促进底物有效地溶解，达到提高转化率的目的，但是有机溶剂对细胞具有很大的毒性，并且会给环境带来污染，其危害作用不容小视。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种离子液体/水双液相系统中利用雷斯青霉催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮生成15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，该方法具有目标产物转化率高、过程简单、绿色环保的优点。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法，包括雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)发酵、加入底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化，其特征在于：所述生物转化的体系由离子液体和缓冲液相构成，其中离子液体相和缓冲液相的体积比为0.25～1.25∶1。

而且，所述离子液体包括[BMIM][PF6]、[HMIM][PF6]、[BMIM][NTF2]、[HMIM][NTF]、[BMPL][NTF]、[HMPL][NTF]、[BMPL][FAP]、[HMIM][FAP]、[EWTMG][FAP]、[(E2OH)MIM][NTF]、[(EOE)MMO][NTF]、[(MOP)MPI][NTF]、[(P3OH)PYR][NTF]；所述缓冲液相为pH5～7.3的磷酸缓冲液；

而且，所述底物左旋乙基甾烯双酮进行生物转化的底物投料量的重量百分比为2～7‰，温度为25～30℃，摇床转速为160～200r/min，转化时间为90～100h。

而且，所述雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)发酵步骤为：

(1)孢子悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)接种到斜面培养基上，经培养后用无菌水，含量为质量百分比1‰的Tween-80水溶液，将斜面孢子洗下，制备出孢子悬液；

(2)菌丝培养：将已制备好的孢子悬液接入到发酵培养基中，培养温度28～32℃，接种量为10⁸～10¹¹个/ml，摇床转速为160～200r/min，培养时间为24～72h；培养成熟后所得球状菌丝体经抽滤获得菌饼。

而且，所述菌饼投入到离子液体/水两相系统的水相中的菌球重量占水相质量的5～8％。

而且，所述斜面培养基wt％：葡萄糖1.5，麦芽糖2，蛋白胨0.1，琼脂2，pH自然；所述发酵培养基wt％：葡萄糖3，玉米浆1，NaNO₃0.2，KH₂PO₄0.1，MgSO₄0.05，FeSO₄0.002，KCl 0.05，K₂HPO₄0.2，pH 7.2～7.5。

而且，所述将抽滤得到的菌饼投入到缓冲液相中，再加入离子液体，同时以干粉投料的方式将底物投入到离子液体/缓冲液相系统中进行微生物转化。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明方法是在离子液体/水双液相系统中，利用雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC10490)菌体中所含的羟化酶，催化左旋乙基甾烯双酮的15α位发生羟基化反应，生成15α羟基左旋乙基甾烯双酮，制备过程中无需加入有机溶剂，降低了对环境具有严重破坏作用的有机溶剂的使用，反应条件温和，转化装置简单，原料来源充足，制备过程简单，生产成本低，对环境污染危害小，同时可以降低生产成本。