[发明专利]神经干细胞培养扩增方法及所用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养扩增领域。本发明特别涉及用于神经干细胞培养扩增的培养基以及使用所述培养基培养扩增神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎和成体脑、脊髓等神经组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。

神经干细胞通常的分离提取方法是，采用化学或机械方法将胚胎或成体的脑、脊髓等神经组织分散成单细胞后，或者对培养的干细胞进行定向诱导分化后，对获得的细胞混合液初步培养一段时间，由于神经干细胞具有形成神经球的特性，可以通过挑选神经球的方法从中分离获得少量神经干细胞。

神经干细胞通常的培养扩增方法是，将用前段所述方法获得的神经球作为初始种子，接种入含血清或不含血清的培养液，置于5％CO₂、37℃条件下培养，每培养到一定程度就挑选合适的神经球进行消化传代，实现细胞数量扩增，以满足研究或测试需求的数量和质量。(《人胚神经干细胞的分离培养和鉴定》，罗树伟，谢常青，卢光，中南大学学报(医学版)，2004，29(2)：129-131；《早期人胚神经干细胞分布及分离培养》，吕海侠，翟伟，刘勇等，西安交通大学学报(医学版)，2003年4月第24卷第2期：97-100；《胎鼠脊髓源性神经干细胞分离培养与鉴定》，李勇，敬晓棋，窦忠英，中国生物工程杂志，2005，25(6)：25-30；《诱导人脐血神经干细胞向神经细胞分化的研究》，季旭东，高超，杨月景，河南医学研究，2005年9月第14卷第3期：215-219；《异体和自体骨髓源神经干细胞周围神经移植实验研究》，李贵涛，徐如祥，姜晓丹等，中国矫形外科杂志，2007年7月第13卷第14期，1087-1089；《人和小鼠神经干细胞的体外培养的分化研究》，吴益民，喻红，林丽珠等，复旦学报(自然科学版)，2002年2月第41卷第1期，57-62)。

由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，虽然有血清时培养扩增效率较高，然而无血清培养仍然成为发展趋势，目前一般采用添加了生长因子、抗生素等成分的DMEM或者DMEM/F12培养液作为神经干细胞的无血清培养液(《体外血清预培养促进神经干细胞增殖》，万虹，历俊华，张绍东，中国临床康复，2006，10(45))。

神经干细胞有静态培养和动态培养两种方式，前者是用细胞培养瓶放在温箱中静态条件下培养，在无血清条件下扩增效率较低(《哺乳动物神经干细胞扩增技术研究进展》，董良，齐瀚实，生物技术，2005，15(4))；后者是利用细胞培养生物反应器在旋转等动态条件下培养，扩增效率较高，然而生物反应器价格昂贵，并且部分情况下为了实验的方便或由于实验条件的要求，神经干细胞不适合用生物反应器进行培养扩增。

此外，目前神经干细胞培养还需要添加抗生素，有可能对神经干细胞的进一步应用造成影响。

发明内容

本发明提供了一种新的神经干细胞培养扩增方法，其对神经球的挑选、培养液的配方和换液时机等接种培养工艺进行了改进，实现了在静态培养条件下神经干细胞10-15天的扩增效率达到7-14倍，并且本发明所述方法不需要添加抗生素，更好的满足科研和工业化生产的需要。

在一个方面，本发明提供了一种神经干细胞培养扩增方法，所述方法包括：

(a)将神经干细胞接种在包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12或DMEM培养基中培养；

(b)2、3或4天后在培养基中添加5-20％体积的营养补充液并继续培养，其中所述营养补充液是包含1×B27添加剂，1×N2添加剂，1.0-3.0mM的L-谷氨酰胺，0.5-1.5mM的丙酮酸钠，0.5-1.5mM的N乙酰半胱氨酸(NAC)，50-150ng/ml的bFGF，50-150ng/ml的EGF以及1-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F12或DMEM培养基；

(c)监测培养基中形成的神经球直径，当60％以上、优选70％以上神经球直径高于阈值时，分离直径高于所述阈值的神经球，消化后收获，其中所述阈值为200-500μm，例如为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm；