[发明专利]一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病菌的快速检测方法，特别涉及甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法。

背景技术

由木质部赖氏小杆菌（Leifsonia xyli subsp. Xyli,Lxx）引起的甘蔗宿根矮化病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性较严重的甘蔗病害。其主要传播途径是带病（菌）种苗（茎）传播。种植甘蔗脱毒（菌）种苗是防治甘蔗宿根矮化病的重要途径，建立准确、可靠、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌快速检测方法，是甘蔗脱毒（菌）种苗生产的关键技术之一。

目前检测甘蔗宿根矮化病菌的方法有剖茎检测法，相差显微镜检测法，免疫学，PCR。但甘蔗宿根矮化病早期没有明显的外部症状、内部症状，所以剖茎检测法和相差显微镜检测诊断可靠性差；而病原菌细小且极难培养，免疫学方法准确率不高，灵敏度差，还会出现假阳性；目前应用于甘蔗宿根矮化病的PCR检测技术，首先是提取DNA，然后进行PCR扩增，普遍认为提高了检测的灵敏度，但是该技术还不够成熟，尤其检测结果的重复性和稳定性差。基于上述方法存在的不足，本发明自行设计引物，采用巢式PCR对甘蔗宿根矮化病菌进行检测，这样即使样本DNA量很少或质量不高的情况下也可以扩增出应有的产物，国内外均未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR快速检测方法，包括如下步骤：

1)      提取待检样品的全DNA；

2)      以得到的全DNA为模板，以ITS1：5’– AGTCGTAACAAGGTAGCCGT -3’ （SEQ ID NO.1）和ITS2：5’– GTGCCAAGGCATCCACC -3’ （SEQ ID NO.2）为引物，进行首轮PCR，得到首轮PCR产物；

3)      以上述PCR产物为模板，以RL2：5’ –GAGACAGTACTTATCACTTCGG-3’ （SEQ ID NO.3）和RR2：5’– CGACGCAGATTGACCAATGATC -3’ （SEQ ID NO.4）为引物，进行二轮PCR；

4)      对二轮PCR产物进行电泳，根据371 bp目的片断的有无，判断样品为阳性或者阴性。

优选的，首轮PCR的反应体系为：全DNA 1μl（10-100 ng），5U/μl的 Taq酶0.2μl，10×含Mg²⁺ PCR反应缓冲液2.5μl，各dNTPs均为2.5 mmol/L的混合液2μl，5μmol/L的ITS1/ITS2引物各1μl，灭菌超纯水补足至25μl。

优选的，首轮PCR的反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 1min；循环30次；72℃ 10min,4℃ 保存。

优选的，二轮PCR的反应体系为：1μl首轮PCR扩增产物或其10倍稀释液，5μmol/L的引物RL2/RR2各1μl，10×含Mg²⁺ PCR反应缓冲液2.0 μl，各dNTPs均为2.5 mmol/L的混合液1.6μl，5U/μl的 Taq酶0.2μl，灭菌超纯水补足至20μl。

优选的，二轮PCR的反应程序为：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35-40个循环；72℃扩增5min，4℃ 保存。

本发明检测方法灵敏度极高，其最低检测限量不超过100 fg甘蔗宿根矮化病菌Lxx基因组DNA，是常规PCR最低检测限量的1/100～1/1000，即本发明建立的甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测灵敏度较常规PCR检测灵敏度提高100至1000倍。

本发明检测方法特异性强，对甘蔗白条病叶组织、水稻基腐病菌、水稻白叶枯病菌及甘蔗健康叶片基因组总DNA无扩增产物；而对甘蔗宿根矮化病菌基因组DNA能扩增出大小为371 bp的单一目的条带。

本发明检测方法快速，从叶片样品DNA的提取、PCR扩增、电泳检测，一般一天可完成检测。

本发明检测方法适用于甘蔗引种检疫、甘蔗脱毒（菌）种苗质量检测及蔗区宿根矮化病诊断与普查等。

附图说明

图1是甘蔗样品宿根矮化病菌巢式PCR检测结果；

图2是巢式PCR灵敏度检测结果； 

图3是巢式PCR特异性扩增检测试验结果。

具体实施方式