[发明专利]一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体及其用途

说明书

发明领域

本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及一种HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白的嵌合体的构建及其纯化，以及在生物免疫靶向治疗中的作用。 

发明背景 

针对慢性疾病的治疗性疫苗是目前疫苗研究的热点之一，这些疾病包括：慢性病毒感染、过敏性疾病、肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等。与普通预防性疫苗不同的是：治疗性疫苗针对的是自身抗原或外来免疫耐受抗原，因此，治疗性疫苗要发挥治疗作用必须首先打破免疫耐受，产生针对特定抗原的自身抗体或自身反应T细胞。由于治疗性疫苗所针对的靶抗原一般是短肽，抗原性较弱，必须与合适的载体结合后，在免疫佐剂的帮助下才能发挥作用，因此，选择合适的载体及佐剂往往是治疗性疫苗成功的关键。 

目前常用的载体如KLH、破伤风类毒素等，效力一般不强，必须使用佐剂，而常用的佐剂如弗氏佐剂虽然效能较强，但不能应用于人体，铝制佐剂虽然可应用于人体，但免疫效能很弱，而且也存在如脑动脉硬化、铝盐局部堆积等不良反应。因此，理想的治疗性疫苗载体，应该在与靶抗原结合后，在不应用免疫佐剂的情况下，就能有效打破机体的免疫耐受，产生高滴度抗体，发挥治疗作用。 

病毒样颗粒就是这样一类理想的疫苗载体。病毒样颗粒(VLP)是由病毒衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而产生针对与之结合的抗体，由于不具有病毒的核酸成分，因此避免了病毒复制增殖的风险。病毒样颗粒由大量重复结构的衣壳蛋白单体聚合而成，进入体内后可以与特异性B细胞表面的B细胞受体结合并激活B细胞，同时，VLP还可提供外源性T细胞表位而激活辅助性T细胞，从而突破自身免疫耐受。另外每个衣壳蛋白单体一般具有碱性多肽域，如赖氨酸的-NH2，这些碱性多肽域朝向颗粒的外表面，短肽等小分子只要带有合适的氨基酸基团，如-SH，通过异双功能交联剂就能结合并展示于VLPs表面，刺激机体产生抗体。 

目前国内外已制备出多种噬菌体病毒样颗粒，如Qβ噬菌体病毒样颗粒、人乳头瘤病毒样颗粒(HPV)、MS₂病毒样颗粒等。瑞士Cytos公司将Qβ噬菌体病毒样颗粒为载体研制了一系列治疗性疫苗，包括阿尔茨海默病AD疫苗(CAD106)、尼古丁疫苗(NIC002)、过敏性哮喘疫苗(CYT003-QbG10)等，其中其研制的针对血管紧张素II的降压疫苗 (CYT006-AngQb)，已完成IIa期临床实验，针对过敏性鼻结膜炎研制的疫苗(CYT003-QbG10)已完成IIb期临床实验。而比利时葛兰素史克公司(GSK)研制的已经上市的子宫颈癌疫苗Cervarix(TM)的主要疫苗成分就是HPV-16和HPV-18。这些病毒样颗粒显示了强大的免疫原性和人使用之后的安全性。迄今为止，HK97噬菌体病毒样颗粒的研究虽有文献报道，但是对其嵌合体的研究少见，且作为生物免疫靶向治疗载体的用途未见报道。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体。 

本发明的第二个目的是HK97噬菌体病毒样颗粒的嵌合体在生物免疫靶向治疗中的作用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

HK97噬菌体病毒样颗粒蛋白嵌合体HII-HK97-P的制备： 

(1)将编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP4基因插入pETDuet-1质粒(购自Novagen公司)的多克隆位点上； 

(2)在编码HK97噬菌体病毒样颗粒头端的蛋白GP5基因的C端添加表达AFHYESQ短肽的碱基序列，将该GP5基因插入pETDuet-1质粒的多克隆位点上，构建嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P； 

(3)将质粒pETDuet-HK97-P转化至BL21(DE3)感受态细菌，IPTG诱导表达病毒样颗粒嵌合体前体P II-HK97-P； 

(4)6％PEG80004℃沉降病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P； 

(5)强阴离子交换层析纯化所述病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P； 

(6)酸化诱导所述病毒样颗粒嵌合体前体PII-HK97-P成熟膨胀为成熟病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P； 

(7)凝胶层析纯化成熟病毒样颗粒嵌合体HII-HK97-P。