[发明专利]一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。

背景技术

促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一种刺激胰岛素分泌的肽激素，含39个氨基酸，早年是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gila monster)唾液中发现的一种激素物质，其氨基酸序列有53％与人类血液中调控血糖激素即胰高血糖素样肽-1(GLP-1)同源。该物质具有直接降血糖，促胰腺分泌胰岛素作用，是GLP-1受体(GLP-1R)的潜在激动剂；还可以通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰。同时，由于不被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解，Exendin-4在人体内的半衰期为2-3小时，远长于GLP-1的1-2分钟，其稳定性和生物活性明显高于GLP-1，显示较GLP-1更好的治疗效果。目前人工合成的Exendin-4(Byetta)已被用于治疗II型糖尿病患者。然而，由于它的分子量小，能被肾脏快速清除，患者还是需要每天注射两次才能获得满意的治疗效果，血清浓度变化很大，即使一天注射两次亦不能持续刺激GLP-1R，给患者带来诸多不便。Exendin-4展示了比GLP-1更强的降血糖效应，开发长效Exendin-4类药物将更有利于提高其治疗II-型糖尿病的效果。药物研发人员正在尝试改变其分子结构，使药物在降糖的同时还能延长其在体内的持续效果。如Lilly公司采用基因工程方法研制的Exendin-4与免疫球蛋白(Recombumin)在体外结合产生CJC-1134-PC；Exendin-4与聚乙二醇(PEG)以水解化学键融合的PEG40,000-FMS-Exendin-4。

白蛋白是人血清中的重要蛋白组份，占血清总蛋白量的一半。人血清白蛋白由585个氨基酸组成，分子量为66KD。人血清白蛋白表现出多样性，有30种变异分子。人血清白蛋白基因已经被克隆(A.Drgaiczyk et al，PNAS，79：71-75，1982)，并被成功地应用在多种体外表达系统中进行表达。对人血清白蛋白进行改造，如将其410位由R(Arg精氨酸)突变为A(Ala丙氨酸)能够降低蛋白质的降解(S.M.Kerry Williams et al，YEAST，14：161-169，1998)。人血清白蛋白在正常生理状况下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天。白蛋白由于具有较长的半衰期，可以作为一种载体通过与血液中的其他因子，包括生物活性蛋白的结合，从而保持或延长其他因子在体内的生物活性。将一些小分子肽或蛋白质药物与白蛋白进行融合是改进小分子蛋白质或多肽药物半衰期的有效方法。与其他方法相比，构建长效白蛋白融合蛋白药物可以避免复杂的化学修饰和处理过程，因而具有容易操作和更好的经济型优势。白蛋白作为一种药物载体，在临床上已经获得了应用，如：已成熟的长效白蛋白融合蛋白药物有：胰岛素，人生长激素，白介素，干扰素。使用白蛋白作为载体，可以延长药物的半衰期，使这些药物的治疗效果及药理特性获得明显的改善。利用基因工程技术，将白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达构建融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。

将Exendin-4与人血清白蛋白进行融合是开发长效Exendin-4类药物的新途径。专利申请CN101525387A将Exendin-4与人血清白蛋白直接连接获得多肽具有延长Exendin-4半衰期的作用。专利申请CN101240033A将两个串联的Exendin-4与人血清白蛋白直接融合，得到的多肽(Exendin-4)₂-HSA具有比Exendin-4更好的稳定性和体内半衰期。

发明内容

本发明提供一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。在保持Exendin-4的生理特性的基础上，延长其体内作用时间，可开发成为新一代长效治疗糖尿病的药物。

本发明的技术方案：一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白，含有2个多肽区，其1区由2个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是410位由R(Arg精氨酸)突变为A(Ala丙氨酸)的人血清白蛋白，标记为HSA(R410A)，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构表述为：(Exendin-4)₂-HSA(R410A)。

其中Exendin-4氨基酸序列为序列SEQ ID NO：1。