[发明专利]一种ET1稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种ET1稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。

背景技术

高血压(hypertensive disease)是一种以动脉血压持续升高为主要表现的慢性疾病，常引起心、脑、肾等重要器官的病变并出现相应的后果。目前，高血压已成为世界范围内引起心血管事件最重要的可改变因素之一，其危害日趋严重。我国现有高血压人群已逾2亿，其治疗率和控制率仍然不高。内皮素(Endothelin，ET)是日本学者Yanagisawa等从培养的猪主动脉内皮细胞中分离纯化出一种活性多肽，其不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。它是由21个氨基酸组成的多肽，分子量为2400D，ET-1另有两个同分异构体家族即ET-2，ET-3，对于心血管起主要作用的是ET-1。内皮素是迄今所知最强的缩血管物质，其作用时间持久，是一种内源性长效血管收缩调节因子。内皮素还有强大的正性肌力作用，并且缩血管升血压效应还可反射性引起心率抑制，造成心肌供血不足，而且还可诱发心肌细胞糖超载，心律失常以及心肌能量代谢障碍。目前大量研究表碍严重心绞痛、AMI、心肌1/R损伤、经皮腔内成形术的机体ET合成和释放碍显增加，或血管对ET反应性亢进，都可能促进上述病理过程的发生发展。而应用ET抗体或ET阻断剂则可防治高血压等心脑血管疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一种ET1稳定表达细胞系的制备方法。

本发明提供的ET1稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将ET1基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达ET1的细胞系。

上述真核表达载体具体可为pTagLite-Snap、pEGFP-N3等。

为了便于对表达的ET1进行细胞定位，可在真核表达载体上加入能于宿主中表达并产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。

上述宿主细胞可为Hela细胞、MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞等。

利用上述方法制备的ET1稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种筛选预防和/或治疗高血压、缺血性心脏病的药物的细胞模型。

实验证明，本发明的ET1稳定表达细胞株对ET1阻断剂和ET1抗体敏感，作用显著。本发明的ET1稳定表达细胞系为深入探索ET1在高血压中的作用提供实验技术平台，可用于筛选预防和/或治疗高血压的药物。

附图说明

图1为重组表达载体pTagLite-Snap-ET1的构建流程图

图2为各稳定表达ET1细胞系的ET1表达量实验结果

图3为ET1稳定表达细胞系对ET1抑制剂的敏感性分析实验结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例仅为解释性的，绝不意味着以任何方式限制本发明的范围。

本发明的ET1稳定表达细胞系的具体构建流程如图1所示。

实施例1.

重组真核表达载体pTagLite-Snap-ET1的构建

下述实验过程中所用的DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。

根据ET1蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下：正向引物：

5’-ACTGATATCATGGATTATTTGCTCATGATTTTCT-3’(下划线处为限制性内切酶的识别位点)；反向引物：

5′-AACGAGCTCCCAATGTGCTCGGTTGTGGGTCACA-3′(下划线处为限制性内切酶的识别位点)。