[发明专利]定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于环境微生物生态学技术领域，具体涉及一种定量测定湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法。

 

背景技术

当前，淡水湖泊的富营养化问题已成为我国所面临的重要环境问题之一，氮、磷等营养元素的过量输入是导致湖泊富营养化的重要原因。因此，研究氮素在湖泊生态系统中的生物地球化学循环规律可以为阐明湖泊富营养化的形成机理并寻找相应的控制措施提供依据。湖泊沉积物是淡水生态系统的重要组成部分，也是大量微生物类群的栖息地，这些微生物类群在湖泊中氮、磷等营养元素循环方面发挥着重要的作用，对于维持湖泊生态系统的健康和稳定具有重要的意义。

湖泊生态系统中的氮循环包括硝化、反硝化等复杂过程。硝化作用是其中非常关键的一个环节，包括两个反应步骤，第一个步骤是将氨氧化成亚硝酸盐，第二个步骤是将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。第一步氨氧化过程是整个反应的限速步骤，主要由氨氧化细菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea，AOA）这两类微生物完成。与AOB相比，AOA不论是在数量、多样性及其栖居范围等各方面都高于AOB。因此，对于湖泊沉积物中AOA的定量研究有助于阐明湖泊沉积物中氮循环作用的相关机理。

很长一段时间以来，对于环境样品中微生物的数量及多样性的研究主要依赖分离培养和显微镜观察等传统方法。这些传统方法周期长、误差大，无法准确地反映湖泊沉积物中氨氧化古菌的数量。因此，迫切需要有新的方法对AOA进行定量表征，只有这样才能在此基础上进一步探索缓解湖泊富营养化的新方法。

 

发明内容

本发明的目的在于克服传统技术的缺陷，而提供一种湖泊沉积物中氨氧化古菌的荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

（1）DNA的提取

采集湖泊沉积物样品并进行冷冻干燥。称取5 g冻干之后的沉积物样品放入50 mL离心管中，加入9 mL无菌水，2 mL Tris-HCl缓冲液，2.5 mL EDTA溶液和5 mL 10% SDS溶液。混合后，65℃水浴60 min。12000 rpm室温离心10 min。上清液收集在50 mL离心管中，加入3 mL 5M NaCl和2 mL 10% CTAB溶液和10 mL蛋白酶K，轻微混匀，65℃水浴保温20 min。上清液中加入16 mL 氯仿:异戊醇混合液（24：1体积比），轻微混匀1 min，3000 rpm室温离心5 min。将上层水相移入50 mL离心管，加入0.1倍体积3M NaAc和0.6倍体积异丙醇，轻微混匀，4℃冰浴60 min，4℃下12000 rpm离心20 min。弃去上清液，沉淀用5 mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm （4℃）再离心10 min。弃去上清液，沉淀风干，溶解于50 mL TE缓冲液（pH 8.0）。

（2）氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析

通过氨氧化古菌特异性引物Arch-amoAF和Arch-amoAR对提取得到的DNA进行扩增。扩增反应体系为50 mL，包含10×PCR缓冲液5 mL，2.5 mM Mg²⁺ 4 mL，4 mL dNTPs （各2.5 mM），上下游引物各1 mL（10 mM），Taq DNA聚合酶2 U。扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共45个循环，最后在72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化，纯化后的产物与Promega公司的pGEM T-Easy载体在4℃连接过夜。连接产物转化至感受态细胞（DH5a）并涂平板培养过夜。在平板上挑取白色单克隆菌落用LB培养基进行扩大培养，用Axygen的小量质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR验证后在紫外分光光度计上测定其浓度并换算为氨氧化古菌的拷贝数，-20℃保存备用。