[发明专利]用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断癌胚抗原的方法。

背景技术

恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病，其中消化系统恶性肿瘤的发病高居首位。据国内有关临床调查显示，近年来大肠癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等消化系统恶性肿瘤在人群中发病率有所上升，消化系统恶性肿瘤约占所有肿瘤发病的60～70％，位居第一，在死亡率“排行榜”上也是“名列前茅”，且呈年轻化趋势，因此开展消化系统肿瘤诊断治疗研究的重要性不言而喻。这表明，未来我国对于高质量的消化系统肿瘤诊断产品，尤其是CEA诊断产品的需求将越来越大。

大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌。在成年人胃肠道中也有少量合成，但不进入血液系统而是通过胃肠道排出，因此，在正常成年人血清中只有微量的癌胚抗原，浓度小于5ng/mL。在胃肠道肿瘤时，血清中的癌胚抗原会明显升高，如果血清中的癌胚抗原超过每升血20μg，提示有胃肠道肿瘤。但是其他的恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、乳腺癌以及一些良性疾病如非特异性结肠炎、胶原性疾病、心血管疾病等也会升高。

癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计，是一个较好的肿瘤标志物。临床上对CEA的检测常作为结肠癌、胃癌、直肠癌、食道癌等早期辅助诊断及癌症术后有无复发的检测指标。良性肿瘤，炎症和退行性疾病，如结肠息肉，溃疡性结肠炎，胰腺炎和酒精性肝硬变病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20ng/mL，CEA超过20ng/mL时往往提示有消化道肿瘤。所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。

一些肿瘤如早期胃癌70％以上无明显症状，给早期诊断带来了困难，一旦临床上出现了明显症状，往往已属于病变的晚期。因此，早期发现并及时就诊成为提高治愈率的焦点问题，而目前，对于消化系统肿瘤的早期检测集中于癌胚抗原CEA这一特异性蛋白。较高的CEA水平意味着癌症也许会存在，这时就需要进行活检来确认诊断。目前，临床上常用的CEA检测的方法为ELISA，CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。开发简单、快速的癌胚抗原诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。

利用胶体金的检测方法测定血清中CEA作为结肠癌、胃癌、直肠癌、食道癌等早期辅助诊断及癌症术后有无复发的检测指标，已被开发，其检测下限为5ng/mL。但是对于临床上单独使用5ng/mL这一标准不能直接、快速区分良性与恶性肿瘤，所以开发能够检测CEA 5～20ng/mL这一CEA诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。

发明内容

本发明的目的：开发简单、快速的癌胚抗原诊断方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测CEA的方法。并且能够半定量检测5ng/mL～20ng/mL这一CEA灰区范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗CEA单克隆抗体1并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的CEA单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

本发明方法包括如下步骤：

一、胶体金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％柠檬酸三钠溶液；