[发明专利]骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用

权利要求书

1.一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。

2.一种如权利要求1所述的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽氨基酸序列的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用噬菌体展示技术分别进行人成纤维细胞的阴性筛选和骨髓间充质干细胞的阳性筛选；筛选之后，提取骨髓间充质干细胞，裂解细胞，再提取和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体DNA片段，对其进行测序，即可获取对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)人骨髓间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养：通过人骨髓间充质干细胞的原代培养并传一代，获得阳性筛选细胞；通过人成纤维细胞的原代培养并传十代以上，获得阴性筛选细胞；

(2)阴性筛选：在阴性筛选细胞中加入噬菌体文库，去除噬菌体文库中与P10代ACL细胞结合的多肽片段；

(3)阳性筛选：在阳性筛选细胞中加入步骤(2)中阴性筛选后得到的噬菌体多肽文库菌液，获得阳性筛选后的骨髓间充质干细胞，该细胞结合了噬菌体文库中与其特异性结合的亲和多肽片段；

(4)噬菌体扩增：提取步骤(3)所得骨髓间充质干细胞，制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增；

(5)测量扩增后的噬菌体提取液的滴度，4℃保存；

以上(1)～(5)步骤重复4轮，第1轮筛选加入噬菌体文库原液，以后每轮加入前一轮细胞裂解液扩增后的噬菌体提取液；

(6)提取每一轮所得的和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体DNA片段，进行测序，筛选出对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列：EPLQLKM。

4.一种如权利要求1所述的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽用于修饰植入人体支架的应用。

5.一种用如权利要求1所述的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的方法，其特征在于，包括以下步骤：将选出的骨髓间充质干细胞亲和多肽的3’C末端，连接一个半胱氨酸(C)，利用该半胱氨酸(C)残基与聚己内酯(PCL)电纺丝膜经氨化后的表面-NH₂共价耦联，使得PCL纳米纤维膜支架具有特异性富集骨髓间充质干细胞的性能。

6.一种权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将PCL纳米纤维膜置于异丙醇配置的10％w/v的1，6-己二胺中，37℃，放置1h；

2)通过交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯将PCL纳米纤维膜表面的氨基和亲和多肽相连接。

7.一种权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将PCL纳米纤维膜修剪成与24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入24孔板的孔内，每孔加入500μl的10％w/v的1，6-己二胺/异丙醇溶液，37℃，放置1h；

2)去离子水漂洗3～5遍，双蒸水漂洗3～5遍，PBS冲洗3遍；

3)每孔加入400μl的交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯，室温下放置1h；

4)PBS冲洗3遍；

5)加入0.1mg/ml的多肽溶液，每孔400μl，4℃过夜；

6)去离子水漂洗3遍，-20℃预冻，真空冻干后4℃保存。