[发明专利]血友病致病基因突变检测试剂盒及应用

说明书

所属技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测血友病致病基因是否发生突变的试剂盒。 

背景技术

血友病(Hemophilia)，是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。包括血友病A(甲)、血友病B(乙)和因子XI缺乏症(曾称血友病丙)。前两者为性连锁隐性遗传，后者为常染色体不完全隐性遗传。血友病在先天性出血性疾病中最为常见，出血是该病的主要临床表现。 

血友病分多型，甲型血友病是一种常见的遗传性出血性疾病，由F8基因的突变导致该凝血因子功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病。根据患者血浆凝血因子8活性和临床表现差异，临床上分成重型，中型和轻型。患者主要临床表现为复发性关节出血及血友病性关节病，血友病性假性瘤及囊肿。乙型血友病是凝血因子IX编码基因突变导致该凝血因子功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病。以身体负重关节、软组织及粘膜等身体部位损伤后过量出血或自发性出血为其典型临床特征。根据患者血浆凝血因子9活性大小及其临床症状的差异，本病可分为重型，中型和轻型。 

甲型血友病呈X连锁隐性遗传，发病率约为1/5000男性活婴，女性患者极为罕见，约占血友病的80％。F8基因存在大量不同的突变，这些突变为临床上病人表型的各种显著差异提供了遗传学基础。乙型血友病也呈X连锁隐性遗传，发病率约为男性活婴的1/30000，约占血友病的10％。研究表明，检测F8基因的STR位点、SNP位点能有效地进行甲型血友病的诊断；检测F9基因STR位点能够有效的进行B型血友病诊断。 

由于血友病缺乏根治措施，故通过携带者和患者的产前诊断可避免血友病胎儿的出生，对提高人口素质，减轻社会负担有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种采用DNA测序技术检测导致血友病发病的F8基因和F9基因是否突变的试剂盒。 

本检测试剂盒主要包括以下成分： 

(1)F8基因第1到第32外显子区PCR扩增与测序引物24对，各对引物序列见表1； 

(2)F9基因第1到第8外显子区PCR扩增与测序引物6对，各对引物序列见表2； 

(3)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等； 

(4)常规PCR产物纯化试剂，如SAP酶、ExoI酶等； 

(5)常规DNA测序试剂，如BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、HIDI溶液等。 

表1 F8基因第1-32外显子区的PCR扩增与测序引物序列 

表2 F9基因第1-8外显子区的PCR扩增与测序引物序列 

本试剂盒的使用步骤包括： 

(1)提取样本的基因组DNA； 

(2)PCR扩增： 

针对F8基因第1-32外显子区按照表1设计引物进行PCR扩增，针对F9基因第1-8外显子区按照表2设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积10μl，包含基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP混合液(2.5mM each)0.8μl、10X PCR反应缓冲液(Mg²⁺free)1.0μl、上游引物和下游引物(10μM)各0.2μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、T aq DNA聚合酶(5Units/μl)0.08μl、去离子水5.72μl。反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。 

(3)PCR产物纯化： 

每个反应体系为总体积12.5μl，包含PCR产物10μl，SAP酶(1units/μl)0.375μl，ExoI酶(10units/μl)0.1875μl，去离子水1.9375μl。反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。 

(4)DNA测序反应 

每个反应体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，BigDye mix(25％)1μl，DNA测序引物(3.2μM)1μl，去离子水2μl。反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。