[发明专利]原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达致病基因的动物模型，尤其涉及一种在小鼠视网膜特异表达人突变型OPTN(E50K)基因原发性的开角型青光眼动物模型及其构建方法，属于动物模型的构建领域。

背景技术

OPTN基因是原发性开角型青光眼(Primary open angle glaucoma，POAG)致病基因之一，OPTN基因E50K突变可以导致视网膜神经节细胞(Retinal ganglial cells，RGCs)的凋亡，但机制不清

Chi ZL等(Overexpression of optineurin E50K disrupts Rab8interaction and leads to a progressive retinal degeneration in mice.Chi ZL，Akahori M，Obazawa M，et al.Hum Mol Genet.2010；19(13)：2606-15)公开了一种原发性开角型青光眼的动物模型，其所应用的OPTN(E50K)小鼠转基因基因模型的突变基因均为小鼠源性，由于小鼠的OPTN基因与人类的OPTN基因并不完全相同，这就限制了此类转基因模型在人类原发性开角型青光眼发病机制以及治疗研究中的应用；

Kroeber M等(Transgenic studies on the role of optineurin in the mouse eye.Kroeber M，Ohlmann A，Russell P，et al.Exp Eye Res.2006；82(6)：1075-85)公开的是一种βB1-crystallin-OPTN转基因小鼠模型，即利用鸡晶体蛋白βB1分别建立OPTN转基因小鼠和转化生长因子TGF-β1转基因小鼠，证实OPTN蛋白是一种细胞质蛋白。进一步对OPTN-TGF-β1双转基因小鼠研究发现OPTN蛋白不能对抗TGF-β1诱导的晶体上皮凋亡过程，表明OPTN蛋白可能不参与TGF-β1基因调控路径，但此研究的重点不是青光眼，而且并未对OPTN(E50K)突变模型进行制作和研究。

小鼠在细胞和组织器官的生理结构、功能特征以及众多生化途径与人类相似；在一定程度上能够控制外界因素对表型的影响；小鼠同时拥有众多的近交系，可迅速繁殖，人们可在相对均一的遗传背景下分析转入目的基因的功能。利用转基因手段建立原发性开角型青光眼致病基因小鼠模型，有助于系统地研究人类OPTN(E50K)突变致POAG的发病机制及发生发展趋势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的原发性开角型青光眼致病基因动物模型的构建中所存在的不足，提供一种新的原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法。本发明鉴于鼠源的OPTN(E50K)基因与人类基因的不同，将人的OPTN(E50K)引入视网膜特异启动子，利用转基因技术，使小鼠的视网膜特异表达人的OPTN(E50K)基因，建立了OPTN(E50K)突变致原发性开角型青光眼的模型，为系统地研究人类OPTN(E50K)突变致POAG的发病机制、发生发展趋势、疾病的转归以及治疗开辟了新的道路，提供了研究动物。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种原发性开角型青光眼致病基因动物模型，其构建方法包括以下步骤：

1、将人OPTN(E50K)突变基因克隆到带有视网膜启动子c-kit的表达载体中，构建得到重组哺乳动物表达载体；

2、将所构建的重组哺乳动物表达载体导入到小鼠体内，筛选鉴定获得转基因小鼠，即得。

其中，所述的人OPTN(E50K)突变基因是将OPTN的ORF区148位G突变为A；所述的视网膜启动子c-kit是小鼠视网膜启动子c-kit；所述的表达载体是pcDNA3.0。

本发明的一个优选的整体技术方案的详述：

1、pcDNA3-C-Kit-OPTN(E50K)转基因载体质粒构建

(1)将视网膜启动子c-kit插入到表达载体；

(2)将OPTN(E50K)突变基因克隆到带有c-kit的表达载体，获得pcDNA3-C-Kit-OPTN(E50K)表达质粒

2、小鼠受精卵品系：C57*CBA F 1小鼠

3、转基因小鼠制备方式：小鼠受精卵细胞雄原核DNA显微注射，将注射卵分别移植到假孕母鼠的输卵管中，将出生小鼠经基因组DNA的PCR检测，获得转基因阳性小鼠，称作Founder，即首建鼠。